張鮮姣, 呂穎穎, 朱紅惠

廣東省微生物研究所, 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省微生物菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510070

粘細(xì)菌是一類能夠滑動的、具有多細(xì)胞行為的革蘭氏陰性菌，可形成形態(tài)各異、顏色多樣的子實(shí)體結(jié)構(gòu)[1]。因其能產(chǎn)生豐富多樣的活性次級代謝產(chǎn)物，被公認(rèn)為是繼放線菌、芽孢菌之后的又一藥源微生物新類群[2]，具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于粘細(xì)菌難以分離純化，使其可用于活性物質(zhì)篩選的種質(zhì)資源遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于其他細(xì)菌。從1892年[3]發(fā)現(xiàn)第1株粘細(xì)菌至今的百余年時(shí)間里，分離獲得可培養(yǎng)的粘細(xì)菌共3個亞目、11個科、28個屬、60多個種(http://www.bacterio.net)。

粘細(xì)菌作為微生物中重要的捕食者和大分子物質(zhì)降解者，廣泛分布于從陸地到海洋的各種環(huán)境中，并以其特有的形式參與到地球生物圈的物質(zhì)循環(huán)中。多年來，已有研究對全球各類環(huán)境中粘細(xì)菌的分布進(jìn)行了廣泛的調(diào)查和研究[4]。近年來，研究人員從土壤環(huán)境中分離到較多的粘細(xì)菌新種[5～9]，同時(shí)又從海洋環(huán)境中分離出多株耐鹽或嗜鹽粘細(xì)菌[6～14]，但有關(guān)從淡水環(huán)境中分離粘細(xì)菌的研究報(bào)道較少[15～20]。如李越中教授團(tuán)隊(duì)從程海湖底泥分離到113株粘細(xì)菌[16]；何麗明等[19]從衡水湖樣品中獲得了4個屬的24株粘細(xì)菌；研究人員在對鄱陽湖底泥樣品進(jìn)行高通量測序時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在大量的粘細(xì)菌序列(2.5%)[21]。

濕地是介于陸地生態(tài)系統(tǒng)和水生生態(tài)系統(tǒng)之間的過渡地帶，被譽(yù)為“地球之腎”，具有獨(dú)特的功能和特性，是自然界最具生物多樣性的生態(tài)景觀，也是人類最重要的生存環(huán)境之一。微生物是濕地物質(zhì)循環(huán)和能量循環(huán)的參與者，在維持濕地生態(tài)系統(tǒng)平衡中發(fā)揮著重要作用，是不可缺少的一部分[22,23]。

廣東省位于我國大陸南端，分布著多條河流、湖泊且擁有綿長的海岸線，孕育了豐富的濕地資源，其中包括近海與海岸濕地、河流濕地、湖泊濕地、沼澤濕地和人工濕地等類型[24]。本文選取近海岸濕地(南沙濕地)、湖泊濕地(肇慶星湖濕地)和人工濕地(海珠濕地)為研究對象，分析不同類型的濕地環(huán)境中粘細(xì)菌的多樣性，并獲得純培養(yǎng)物，以期為其后續(xù)開發(fā)利用及其活性代謝產(chǎn)物的研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，并為濕地環(huán)境粘細(xì)菌資源的挖掘提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1樣品采集 本研究所用樣品于2013年10月和2014年9月采自廣東海珠濕地、南沙濕地及肇慶星湖濕地。采用自制的柱狀采樣器隨機(jī)采集濕地底泥樣品84份，采樣深度為50～150 cm；樣品采集后分裝于無菌采樣袋中；室溫風(fēng)干7～10 d后過2 mm篩子，隨后裝于無菌袋中，置于4℃保存。

1.1.2培養(yǎng)基 水瓊脂培養(yǎng)基(WCX)、CNST瓊脂培養(yǎng)基、VY/2瓊脂培養(yǎng)基和CAS培養(yǎng)基配方參考Rechenbach等[1]的研究。

1.2 粘細(xì)菌分離、純化

1.2.1樣品預(yù)處理： 稱取10.0 g 風(fēng)干樣品于滅菌培養(yǎng)皿中，加入含有放線菌酮及制霉菌素(放線菌酮:制霉菌素為1∶1，終濃度均為200 μg/mL)的無菌水中，室溫浸泡過夜。

1.2.2粘細(xì)菌分離： 在超凈工作臺中，將浸泡好的土樣接種到用助長菌(GIMCC1.611)[25]及大腸桿菌交叉劃線的水瓊脂培養(yǎng)基和CNST培養(yǎng)基的濾紙上。置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第5天開始觀察子實(shí)體的形成情況，隨后每間隔3～5 d觀察1次，連續(xù)觀察1個月以上。

1.2.3粘細(xì)菌純化與保藏： 體式鏡下挑取子實(shí)體轉(zhuǎn)接于VY/2瓊脂培養(yǎng)基上。待長出子實(shí)體或擴(kuò)展的菌膜后，挑取子實(shí)體或菌膜邊緣繼續(xù)純化，直至無雜菌生長。而后將菌株挑取到CAS液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min，振蕩培養(yǎng)10 h。若培養(yǎng)基變渾濁，則說明菌株不純；若培養(yǎng)基澄清，則表明菌株已純。將純菌株接種于VY/2斜面培養(yǎng)基，待長出子實(shí)體及菌膜后，置于4℃保存；將純菌株加入30%滅菌的甘油中，置于-80℃長期保存；同時(shí)，將純菌株加入牛奶保護(hù)劑中進(jìn)行凍干保藏。

1.3 菌株鑒定

1.3.1形態(tài)鑒定 根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[1,26]中粘細(xì)菌的分類標(biāo)準(zhǔn)，記錄粘細(xì)菌的子實(shí)體顏色及形態(tài)、營養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子的形態(tài)大小以及菌落形態(tài)特征等，并據(jù)此將粘細(xì)菌大致歸類到屬。

1.3.2分子鑒定 采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取菌株DNA，以通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)PCR擴(kuò)增16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，27F/1492R(10 μmol) 各0.5 μL ， 模板 DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后交至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。采用在線分析工具Ezbiocloud(http://www.ezbiocloud.net)對菌株16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性分析，確定菌株的種屬地位。取相似性較高的模式菌株16S rRNA基因作為參比，利用ClustalX做多序列比對分析，再用MEGA軟件以鄰位法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，完成可培養(yǎng)粘細(xì)菌的多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕地環(huán)境粘細(xì)菌的分離及鑒定

從廣東海珠濕地、南沙濕地及肇慶星湖濕地采集底泥樣品共84份；采用助長菌誘導(dǎo)法及濾紙誘導(dǎo)法進(jìn)行分離純化，共獲得粘細(xì)菌67株。根據(jù)子實(shí)體和菌落的形態(tài)、顏色等特征，并結(jié)合16S rRNA基因序列分析結(jié)果，將這些菌株初步鑒定為7個屬(圖1，彩圖見圖版三)，分別是粘球菌屬(Myxococcus)32株、珊瑚球菌屬(Corallococcus)15株、孢囊桿菌屬(Cystobacter)2株、多囊菌屬(Polyangium)5株、原囊菌屬(Archangium)7株、匣狀球菌屬(Pyxidicoccus)5株、波管狀菌屬(Hyalangium)1株。

從分離培養(yǎng)基上觀察到的粘細(xì)菌子實(shí)體形態(tài)多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜(圖2,彩圖見圖版四)。有的子實(shí)體單生，如粘球菌屬菌株子實(shí)體多以單生為主(圖2 A、H)；有的聚集成鏈狀或者成團(tuán)，如原囊菌屬及珊瑚球菌屬(圖2 E、I)；有的不形成子實(shí)體，而呈輻射狀向外延伸，如多囊菌屬(圖2D)。不同種屬子實(shí)體的顏色也存在較大的差異，主要有黃色、橙色、白色、粉紅色、棕色、褐色和黑色。

圖1 濕地環(huán)境中分離到粘細(xì)菌分布情況Fig.1 The distribution of myxobacteria in wetland. (彩圖見圖版三)

從WXC培養(yǎng)基及CNST分離培養(yǎng)基中共挑取到271株粘細(xì)菌，經(jīng)多次挑取邊緣子實(shí)體或菌膜進(jìn)行純化、去重復(fù)后，共得到67株純培養(yǎng)物。從VY/2瓊脂培養(yǎng)基上觀察，菌落形態(tài)及顏色較為多樣(圖3,彩圖見圖版四)。有的向外擴(kuò)張成大的菌落，如粘球菌屬及原囊菌屬菌株(圖3B、C)；有的形成細(xì)密的子實(shí)體，多數(shù)為珊瑚球菌屬(圖3E)；有的刻蝕瓊脂，如多囊菌屬(圖3D)；而顏色有黃色、橙色、黃褐色以及褐色。在長期反復(fù)的轉(zhuǎn)接過程中，部分粘細(xì)菌子實(shí)體退化。如大部分原囊菌屬(Archangium)以及孢囊桿菌屬(Cystobacter)的菌株不形成子實(shí)體；而孢囊菌屬粘細(xì)菌隨著轉(zhuǎn)接次數(shù)增多會越長越弱，甚至死亡。

圖2 部分粘細(xì)菌子實(shí)體圖Fig.2 Morphological characteristics of fruiting body of some myxobacteria strains. A：x18j31，粘球菌；B：23j22，粘球菌；C：x19x31，孢囊桿菌；D：60ax32，多囊菌；E：x3x2，原囊菌；F：y53x22，匣狀球菌；G：46ax41，波管狀菌；H：20j1，粘球菌；I：51ax31，珊瑚球菌。 (彩圖見圖版四)

圖3 部分粘細(xì)菌菌落圖Fig.3 Morphological characteristics of swarm of some myxobacteria strains. A：x18x21，匣狀球菌；B：x12x1，粘球菌；C：x3x2，原囊菌；D：60ax32，多囊菌；E：32j1，珊瑚球菌；F：x19x31，孢囊桿菌。 (彩圖見圖版四)

2.2 濕地環(huán)境可培養(yǎng)粘細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析

選取27株已測序菌株及相似性最高的模式菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)。從發(fā)育樹上可發(fā)現(xiàn)，27株粘細(xì)菌大體可分為3個分支。第1分支屬于粘球菌科(Myxococcaceae)，第2分支屬于孢囊桿菌科(Cystobacteraceae)，第3分支屬于多囊菌科(Polyangiaceae)。第1分支中包含3個屬，分別是粘球菌屬、珊瑚球菌屬和匣狀球菌屬，本研究分離到的大部分粘細(xì)菌屬于這一分支。其中粘球菌屬(Myxococcus)與匣狀球菌屬(Pyxidicoccus)菌株聚類在一起，區(qū)分不開。珊瑚球菌屬(Corallococcus)的4株菌(8x1、15ax1、x9x2、69ax1)與模式菌株弱小珊瑚球菌(CorallococcusexiguusDSM14696)及珊瑚狀珊瑚球菌(CorallococcuscoralloidesDSM2259)聚集成獨(dú)立一支。第2分支為孢囊桿菌科，包括原囊菌屬、孢囊桿菌屬和波管狀菌屬。菌株46ax41與HyalangiumminutumDSM14724聚類在一起；菌株x2j32、15j1、x3x2與原囊菌屬、孢囊桿菌屬和波管狀菌屬聚為一支。第3分支為多囊菌屬，菌株y55x31、6x11、15j22與多囊菌屬模式菌PolyangiumfumosumPl fu5、PolyangiumsorediatumPl s21聚成一類。從16S rDNA進(jìn)化樹上看，各菌株分類地位較為明確。

2.3 不同類型濕地環(huán)境中粘細(xì)菌分布情況

本研究對海珠濕地、南沙濕地、肇慶星湖濕地的粘細(xì)菌分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(表1)。從海珠濕地28份樣品中分離到5個屬的19株粘細(xì)菌；從南沙濕地23份樣品中分離到6個屬的25株粘細(xì)菌，其中分離到1個海洋粘細(xì)菌特有的屬——波管狀菌屬；從肇慶星湖濕地33份樣品中分離到5個屬的23株粘細(xì)菌。

由表1可知，在3個濕地中，出菌率最高的是海珠濕地(50.0%)，其次為星湖濕地(45.4%)，最低的為南沙濕地(43.5%)。從分離的種群來看，粘球菌屬(Myxococcus)分離到的數(shù)量最多，出菌率明顯高于其他種屬；其次為珊瑚球菌屬(Corallococcus)。這可能是因?yàn)楸狙芯坎捎玫姆蛛x方法對粘球菌屬和珊瑚球菌屬較為有效，且這2種菌也較為常見。

3 討論

本研究對廣東海珠濕地、南沙濕地及肇慶星湖濕地的84份底泥樣品進(jìn)行了粘細(xì)菌的分離純化，從中共獲得2個亞目、3個科、7個屬的67株粘細(xì)菌。初步鑒定為粘球菌屬32株、珊瑚球菌屬15株、孢囊桿菌屬2株、多囊菌屬5株、原囊菌屬7株、匣狀球菌屬5株、波管狀菌屬1株。本實(shí)驗(yàn)分離到的粘細(xì)菌菌株約93%屬于孢囊桿菌亞目(Cystobacterineae)，而多囊菌亞目(Sorangiineae)僅分離到多囊菌屬的菌株，未曾分離到侏囊菌亞目(Nannocystineae)的粘細(xì)菌菌株。主要原因是多囊菌亞目和侏囊菌亞目的粘細(xì)菌多數(shù)處于未培養(yǎng)狀態(tài)，并且侏囊菌亞目粘細(xì)菌多為來源于海洋環(huán)境的嗜鹽或耐鹽粘細(xì)菌。查閱近幾年粘細(xì)菌的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)大部分粘細(xì)菌新種屬來自于多囊菌亞目和侏囊菌亞目，可見自然環(huán)境中存在著大量的粘細(xì)菌新類群，并有待進(jìn)一步發(fā)掘。

圖4 濕地27株粘細(xì)菌及模式菌株16S rDNA基因NJ進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 27 myxobacteria strains and reference stains based on 16S rDNA genes.

取樣地點(diǎn)樣品數(shù)(份)出菌樣品數(shù)(份)樣品出菌率(%)分離到的各屬粘細(xì)菌(株)粘球菌屬珊瑚球菌屬孢囊桿菌屬多囊菌屬原囊菌屬匣狀球菌屬波管狀菌屬總計(jì)海珠281450．0660133019南沙231043．51642110125星湖331545．41050332023共計(jì)843946．432152575167

本研究從不同類型濕地環(huán)境中獲得了粘球菌屬32株、珊瑚球菌屬15株，兩者占粘細(xì)菌總數(shù)的58.2%。究其原因有：①粘球菌屬、珊瑚球菌屬的粘細(xì)菌生長速度較快，3～5 d即可形成子實(shí)體，所以受其他雜菌污染較少，易于純化。②粘球菌子實(shí)體顏色鮮艷，以橙色、黃色居多，且子實(shí)體單生、體型大，相對而言易于挑??；而珊瑚球菌屬子實(shí)體生長易連成一片，子實(shí)體為橙色且小，呈珊瑚狀的分支，無粘液包裹，易于挑取。③本研究采用的分離純化方法可能易于這兩者的分離。粘細(xì)菌分離主要依靠在體式鏡下挑取子實(shí)體，而這兩者的子實(shí)體無粘液包裹，挑取時(shí)夾帶的雜菌少，基本一經(jīng)轉(zhuǎn)接就可以純化，相對其他種屬的粘細(xì)菌而言較為簡單，耗時(shí)少。④這2個屬的粘細(xì)菌適應(yīng)性強(qiáng)，在各類環(huán)境中普遍存在[4]。

粘細(xì)菌曾被認(rèn)為是典型的土壤微生物，但經(jīng)研究證實(shí)，淡水環(huán)境也是粘細(xì)菌的重要生境[27]。本研究從不同類型濕地環(huán)境中分離到了7個屬的67株粘細(xì)菌，其中還純化到海洋環(huán)境中特有的波管狀菌屬(Hyalangium)1株，并且分離到的5株多囊菌屬菌株與模式菌株P(guān)olyangiumfumosumPl fu5最大相似性均小于98.6%，為潛在新物種。由此可見，在濕地環(huán)境中存在著豐度較高的粘細(xì)菌類群，并且其中一些類群還是尚未獲得純培養(yǎng)物的稀有粘細(xì)菌物種資源。

本研究表明，濕地底泥環(huán)境中蘊(yùn)含著豐富的粘細(xì)菌資源，但由于受到分離純化方法的限制，仍有大量的粘細(xì)菌類群未能得到純培養(yǎng)物，所以，優(yōu)化粘細(xì)菌分離純化方法以獲得更多的粘細(xì)菌資源顯得尤為重要。另外，對于已分離到的粘細(xì)菌應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，并對其產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入研究，以完善對濕地環(huán)境粘細(xì)菌資源及其代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用。與此同時(shí)，湖泊底泥樣品有機(jī)質(zhì)豐富，所處環(huán)境氧含量較低，是分離厭氧粘細(xì)菌的重要來源之一，后續(xù)可對濕地環(huán)境中可培養(yǎng)的厭氧粘細(xì)菌進(jìn)行探索分離。

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