張飛飛, 楊運文, 董慧青, 尚廣東*

1.徐州醫(yī)科大學麻醉學院, 江蘇省麻醉學重點實驗室, 江蘇 徐州 221004;2.南京師范大學生命科學學院, 江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室, 南京 210023

重組工程是指利用重組酶催化的DNA片段之間的同源重組在生物基因組中進行基因克隆或DNA改造的一種基因工程技術(shù)[1,2]。目前廣泛使用的重組酶基因來源于λ噬菌體的Red重組系統(tǒng)，包括exo、bet和gam基因，分別編碼Exo、Beta和Gam 3種蛋白質(zhì)分子。Exo蛋白是一種5′→3′DNA外切酶，結(jié)合在雙鏈DNA的末端得到3′端突出的DNA分子[3]；Bet蛋白是一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，結(jié)合在由Exo消化產(chǎn)生的3′單鏈DNA末端，促進該單鏈DNA末端與互補鏈退火和體內(nèi)重組[4]；Gam蛋白可與RecBCD結(jié)合抑制其降解DNA的活性，協(xié)助Exo和Beta完成同源重組[5]。Red重組已經(jīng)發(fā)展成為一套比較成熟的重組系統(tǒng)，以方法簡便和重組效率高著稱。作為一種高效的打靶技術(shù)，其在功能基因組學方面的研究越來越廣泛。但是Red重組系統(tǒng)也有缺點，利用Red 重組系統(tǒng)敲除目標基因時有外源片段殘留，如在敲除位置殘留一個FRT位點序列[6]。而這些冗余序列的存在可能干擾基因組的總體結(jié)構(gòu)、影響其他基因的表達，如極性效應(yīng)(即一個轉(zhuǎn)錄單位中的一個無義突變能抑制轉(zhuǎn)錄單位中隨后基因的轉(zhuǎn)錄)，也給后續(xù)的基因修飾帶來困難。為實現(xiàn)不含任何冗余堿基的大腸桿菌基因的敲除，即無痕敲除，Yu等[7]利用Red同源重組系統(tǒng)和核酸內(nèi)切酶 I-SceI的篩選作用，通過兩步連續(xù)的同源重組成功實現(xiàn)無痕敲除，但是該方法仍需要通過PCR、限制性酶酶切、連接酶介導的DNA片段連接等步驟構(gòu)建400～500 bp的用于基因修飾的同源片段。

近年來，因長期過度使用抗菌藥物，細菌耐藥性問題日益突出，使感染性疾病的發(fā)病率和病死率居高不下。研究發(fā)現(xiàn)，細菌中的細絲溫度敏感蛋白Z(FtsZ)在細胞分裂中發(fā)揮重要作用，并且高度保守的存在于所有的細菌和古生菌中，被認為是一個非常有潛力的抗菌藥物靶點[8]。

為了進一步改進和優(yōu)化無痕敲除技術(shù)，本研究嘗試通過一種由寡核苷酸介導的重組工程方法(single strand oligonucleotide-mediated recombineering，SSOR)來實現(xiàn)大腸桿菌ftsZ基因的無痕敲除,以期為細菌細胞的分裂機制及影響細胞分裂的蛋白之間相互作用的機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒 pKD4和pKD46質(zhì)粒由美國普渡大學的Barry Wanner教授惠贈，pEX100Tlink由法國尼斯大學醫(yī)學中心的Benoit Polack教授惠贈，pSCrhaB2由加拿大西安大略大學的Miguel Valvano教授惠贈，E.coliDH10B、MG1655、BW25141和pBluescript KS(-)為本實驗室保存的菌種和質(zhì)粒。

1.1.2試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒以及DNA分子量標準購自大連寶生物公司；PCR引物、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、氨芐青霉素(Ampicilin,Amp)、甲氧芐氨嘧啶(Trimethyloprim, TMP)、卡那霉素(Kanamycin, Kan)等抗生素購自上海生工公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR儀為BioRad公司的S1000，電轉(zhuǎn)化儀為BioRad公司的Gene PulserⅡ，紫外分光光度計為日本島津公司的UVmini-1240。

LB培養(yǎng)基(100 mL)：胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g，固體培養(yǎng)基加入2 g瓊脂，115℃高壓滅菌20 min；SOB培養(yǎng)基(100 mL)：胰蛋白胨2 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 0.05 g，KCl 0.09 g，115℃高壓滅菌20 min，使用前加入單獨滅菌的1 mol/L MgCl21 mL；SOC培養(yǎng)基(100 mL)：每100 mL已加入1 mol/L MgCl2的SOB中添加過濾除菌的1 mol/L葡萄糖2 mL。

1.1.3DNA測序 由南京思普金生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1分子生物學常規(guī)操作 大腸桿菌的培養(yǎng)、PCR擴增、質(zhì)粒提取和酶切鑒定等實驗參照手冊[9]進行。表達重組酶的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備，DNA的電轉(zhuǎn)化以及篩選等步驟均采用Kolisnychenko等[10]的方法。本研究所使用的PCR引物序列和寡核苷酸見表1。

1.2.2質(zhì)粒的構(gòu)建 ①含sacB-neo基因盒的質(zhì)粒的構(gòu)建。以pEXT100Tlink為模板，S1和S2為引物，擴增出1.7 kb的sacB基因，將PCR產(chǎn)物以XbaⅠ和BamHⅠ酶切后，克隆至pBluescript KS(-)的相同位點，經(jīng)酶切和測序正確后，命名為pKsacB。將pKsacB經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ酶切后回收1.7 kb的sacB基因和pKD4經(jīng)XbaⅠ和BglⅡ酶切后回收的1.0 kbneo基因通過三片段連接法克隆到pKD4/XbaⅠ位點上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW25141的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，經(jīng)酶切鑒定后，獲得重組質(zhì)粒pSNR。pSNR使用R6K復制子，以含有Pir基因的BW25141為宿主菌，這樣以之為模板所擴增的片段轉(zhuǎn)化到常規(guī)的大腸桿菌如MG1655就不會有質(zhì)粒背景的干擾。以pSNR質(zhì)粒為模板，MFD5-MFD6為引物，PCR擴增得到含有同源臂的sacB-neo基因盒。為了保證靶基因的讀碼框不變，在設(shè)計同源臂序列時，保留了靶基因開放閱讀框中的起始密碼子和終止密碼子。

②大腸桿菌ftsZ基因的克隆。以E.coliMG1655 基因組DNA為模板，MFD1-MFD2擴增的ftsZ基因NdeⅠ-XbaⅠ酶切后克隆至pSCrhaB2/NdeⅠ-XbaⅠ獲得pLS1331，NdeⅠ-XbaⅠ雙酶切鑒定并測序。

1.2.3菌落PCR 從劃線長出的單菌落挑取適量的菌體到50 μL無菌水，混勻后，100℃ 處理5 min，待菌體冷卻，12 000 r/min 離心5 min，每25 μL PCR體系加入5 μL 作為模板。

表1 本研究所用的PCR引物和寡核苷酸Table 1 Oligonucleotides and PCR primers used in this study.

注：下劃線處表示酶切位點。

1.2.4帶有同源臂的sacB-neo基因盒與ftsZ基因之間的同源重組 敲除ftsZ基因的流程如圖1所示，首先將pLS1331熱擊轉(zhuǎn)化至E.coliMGl655/pKD46感受態(tài)細胞中，于30℃、24 h在含50 μg/mL Amp和50 μg/mL TMP的LB抗性平板上篩選得到菌株MGl655/pKD46-pLS1331，其中pKD46和pLS1331使用不同的復制子，即不存在質(zhì)粒不相容性。

隨后根據(jù)Kolisnychenko等[10]的方法制備MGl655/pKD46-pLS1331的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。將1 μg帶有同源臂的sacB-neoPCR產(chǎn)物按照1 800 V、200 Ω的電擊條件轉(zhuǎn)化至MGl655/pKD46-pLS1331的感受態(tài)細胞中，37℃、220 r/min，振蕩培養(yǎng)1 h后，將轉(zhuǎn)化液涂布于含30 μg/mLKan、50 μg/mL TMP、50 μg/mL AMP和0.2% L-鼠李糖的LB平板上，30℃培養(yǎng)24 h。長出來的菌落測定蔗糖敏感性，并利用MFD7-MFD8、MFD7-ZDE4、ZDE4-ZDE5這3對引物進行菌落PCR鑒定，正確的菌株命名為LS1301。

圖1 SSOR法敲除ftsZ基因的流程示意圖Fig.1 Schematic representation of ftsZ gene knockout via SSOR.

1.2.5寡核苷酸與sacB-neo區(qū)域之間的同源重組 用1 800 V、200 Ω同樣的電擊條件將5 pmol MFD9轉(zhuǎn)化至新鮮制備的LS1301電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，最后在37℃振蕩培養(yǎng)1 h，涂布于含有50 μg/mL TMP、50 μg/mL Amp、0.2% L-鼠李糖和10%蔗糖LB平板上，30℃培養(yǎng)24 h。長出來的菌落測定Kan敏感性，并利用MFD7-MFD8引物進行菌落PCR鑒定，并進行測序分析得到LS1302菌株。

1.2.6pKD46質(zhì)粒的消除 pKD46含有溫度敏感型的復制起點oriRl01，在30℃培養(yǎng)時可以正常復制，而高于37℃時會自動丟失。利用此原理，將LS1302菌株在50 μg/mL TMP和0.2% L-鼠李糖LB培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)過夜，稀釋106倍后涂布LB平板，42℃培養(yǎng)過夜，菌落測定Amp敏感性，獲得菌株LS1303，保藏于-80℃冰箱。

1.2.7LS1303生長測定 挑取LS1303單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，于37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600約0.6。取19支試管，每支加入6 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，然后按照1∶100的比例將OD600約0.6的菌液接種至18支試管中，其中1支不接種作為陰性對照，于37℃ 220 r/min持續(xù)培養(yǎng)30 h，每間隔5 h取出3 mL菌液測定OD600值，每個時間點重復測3次，以O(shè)D600為縱坐標、培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 帶有同源臂的sacB-neo 基因盒與ftsZ基因之間的同源重組

將含同源臂的sacB-neo基因盒電轉(zhuǎn)化到E.coliMGl655/pKD46-pLS1331感受態(tài)細胞后，長出462個單菌落。隨機挑選25個單菌落影印至LB平板和含10%蔗糖且不加NaCl的LB平板，30℃培養(yǎng)16 h后，有22個表現(xiàn)為蔗糖敏感。當培養(yǎng)基中添加蔗糖時，sacB基因編碼的果聚糖蔗糖酶可轉(zhuǎn)化蔗糖為細菌毒素聚蔗糖而表現(xiàn)出對菌株的毒性，即含有sacB基因的菌株不能生存。最后從蔗糖敏感的菌落中隨機挑取10個進行菌落PCR，分別以MFD7-MFD8、MFD7-ZDE4和ZDE5-MFD8為引物，最終的結(jié)果如圖2中的泳道2、3、4所示，分別與預期大小3 874 bp、797 bp、997 bp相一致，表明得到了ftsZ基因被sacB-neo基因盒成功取代的LS1301菌株，其基因型為E.coliMGl655 ΔftsZ∷sacB-neopKD46-pLS1331。

圖2 sacB-neo基因盒取代ftsZ基因的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of ftsZ gene replaced by the sacB-neo gene cassette.注：M1:λ-HindⅢ DNA marker; M2:DL2000 DNA marke; 1:以MFD7-MFD8為引物擴增MG1655得到2 488bp產(chǎn)物; 2,3,4:分別以MFD7-MFD8、MFD7-ZDE4、ZDE5-MFD8為引物擴增菌株LS1301得到3874 bp、797 bp、997 bp的產(chǎn)物

2.2 寡核苷酸與sacB-neo區(qū)域之間的同源重組

將SSO(single stranded oligonucleotide)MFD9電轉(zhuǎn)化到LS1301感受態(tài)細胞中培養(yǎng)后長出42個單菌落，并且發(fā)現(xiàn)所有的菌落均表現(xiàn)為Kan敏感。隨機挑取10個表型正確的菌落，以MFD7-MFD8為引物進行菌落PCR驗證，其中8個與預期大小1 342 bp相一致，如圖3中的泳道2所示。另外選取2個PCR產(chǎn)物進行測序分析，結(jié)果顯示序列全部正確，沒有堿基意外突變，表明實現(xiàn)了無任何堿基冗余的ftsZ基因的敲除，將此菌株命名為LS1302，其基因型為E.coliMGl655 ΔftsZpKD46-pLS1331。

隨后根據(jù)1.2.5所述的方法進行pKD46的消除實驗，隨機挑取25個單菌落進行抗性驗證，發(fā)現(xiàn)其中20個均失去了Amp抗性，表明pKD46得以消除，得到基因型為E.coliMGl655 ΔftsZpLS1331的菌株LS1303。

2.3 LS1303生長測定

為了鑒定LS1303的生長情況，嘗試將LS1303在沒有添加L-鼠李糖的LB培養(yǎng)基中生長，菌液始終較澄清，而在添加0.2% L-鼠李糖的條件下，以E.coliMGl655為對照，LS1303的OD600約為MG1655的一半，如圖4所示。這些結(jié)果表明ftsZ基因的敲除是一種條件性敲除，只有在L-鼠李糖誘導pLS1331產(chǎn)生FtsZ蛋白時，細菌才能生長增殖。

圖3 sacB-neo 基因盒敲除的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of sacB-neo gene cassette knockout.注：M:DL2000 DNA marker; 1:以MFD7-MFD8為引物擴增LS1302得到1 342 bp的目的產(chǎn)物

圖4 E. coli MGl655和LS1303在LB培養(yǎng) 基中的生長曲線圖Fig.4 The growth curve of E. coli MGl655 and LS1303 in the LB medium.

3 討論

本研究中所利用的SSOR方法不僅實現(xiàn)了無任何堿基冗余的基因敲除，而且可以直接通過化學合成的寡核苷酸介導，無需PCR、退火、克隆等操作，簡便易行，重組效率高。這在很大程度上降低了成本，節(jié)省了時間，很有可能成為大腸桿菌基因組修飾的通用方法。另外Herring等[11]利用琥珀型突變的重組方法未能獲得ftsZ基因突變株，進一步證明本研究SSOR方法的可行性。目前，本課題組已經(jīng)利用SSOR方法無痕敲除了LacZ基因和RhaSR基因(未發(fā)表數(shù)據(jù))。

本研究中用于基因敲除的含同源臂的寡核苷酸MFD9為84個堿基，前42個堿基和后42個堿基分別與整合到大腸桿菌基因組上的sacB-neo基因盒前42個堿基和后42個堿基相同。長寡核苷酸效率更高，但伴隨的是成本的增加和發(fā)生突變的幾率增加；短寡核苷酸的重組效率會有所下降。所以，同源臂的堿基長度不可限定，一般而言，寡核苷酸的長度可以涵蓋從下限36個堿基到上限約150個堿基(即為DNA堿基合成的上限)。

據(jù)報道，大腸桿菌中約有38%的基因功能尚未研究清楚[12]，研究基因功能最直接的方法是將待研究的基因敲除，而在細胞增殖分裂過程中發(fā)揮著重要作用的ftsZ基因有著較高的科研價值。FtsZ蛋白是一種類似微管蛋白的GTP酶，一些抗腫瘤藥物如埃博霉素，可與微管蛋白結(jié)合導致癌細胞無法順利進行有絲分裂，進而使癌細胞凋亡。所以，ftsZ基因突變株的構(gòu)建為研究細胞分裂、尋找抗菌藥物新靶點甚至腫瘤研究創(chuàng)造了有利的條件。

基因無痕敲除技術(shù)是遺傳工程研究的一次重大飛躍，無痕系統(tǒng)將會得到進一步發(fā)展和完善，在基因的修飾及功能研究方面的應(yīng)用也將更加廣泛。

[1] Zhang Y, Buchholz F, Muyrers J P,etal.. A new logic for DNA engineering using recombination inEscherichiacoli[J]. Nature Genet., 1998, 20(2):123-128.

[2] Sharan S K, Thomason L C, Kuznetsov S G,etal.. Recombineering: A homologous recombination-based method of genetic engineering[J]. Nat. Protoc., 2009, 4(2):206-223.

[3] Poteete A R. What makes the bacteriophage lambda Red system useful for genetic engineering: Molecular mechanism and biological function[J]. FEMS Microbiol. Lett., 2001, 201(1):9-14.

[4] Takahashi N, Kobayashi I. Evidence for the double-strand break repair model of bacteriophage lambda recombination[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87(7):2790-2794.

[5] Murphy K C. The lambda Gam protein inhibits RecBCD binding to dsDNA ends[J]. J. Mol. Biol., 2007, 371(1):19-24.

[6] Datsenko K A, Wanner B L. One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichiacoliK-12 using PCR products[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645.

[7] Yu B J, Kang K H, Lee J H,etal.. Rapid and efficient construction of markerless deletions in theEscherichiacoligenome[J]. Nucl. Acids Res., 2008, 36(14):e84.

[8] Margolin W. FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles[J]. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2005, 6(11):862-871.

[9] Maniatis T: Molecular cloning: A laboratory manual (2nded) [M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989，16-34.

[10] Kolisnychenko V, Plunkett G, Herring C D,etal.. Engineering a reducedEscherichiacoligenome[J]. Genome Res., 2002, 12(4):640-647.

[11] Herring C D, Blattner F R. Conditional lethal amber mutations in essentialEscherichiacoligenes[J]. J. Bacteriol., 2004, 186(9):2673-2681.

[12] Blattner F R, Plunkett G, Bloch C A,etal.. The complete genome sequence ofEscherichiacoliK-12[J]. Science, 1997, 277(5331):1453-1462.