鄭大恒, 王 未, 李 倩, 陳 瑤, 張偉杰, 趙 婷, 仰榴青*

1.紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 紹興 312000; 2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 3.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013;4.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

玫瑰茄(HibiscussabdariffaL.)為錦葵科木槿屬一年生草本植物，原產(chǎn)于東南亞、南美和非洲等熱帶國(guó)家和地區(qū)，目前，我國(guó)浙江、福建、云南、廣東、廣西等地已有大面積種植[1,2]。玫瑰茄作為傳統(tǒng)的藥食同源植物，富含多酚、花青素和類黃酮等物質(zhì)，具有降血壓、提高免疫力、防治心腦血管疾病以及抗腫瘤等功效[3～6]。多糖作為一種生物活性成分，近年研究發(fā)現(xiàn)其具有清除體內(nèi)自由基、抗氧化作用[7]。

活性氧自由基如超氧陰離子自由基和羥基自由基，對(duì)人體或動(dòng)物是一種必需物質(zhì)，但過(guò)量的自由基可導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷，大量證據(jù)表明，人類的許多疾病，如癌癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病，都是自由基氧化損傷的結(jié)果[8]。玫瑰茄花萼中也含有多糖，然而關(guān)于玫瑰茄多糖的研究報(bào)道卻很少。

響應(yīng)面分析法(response surface techodology)是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析、優(yōu)化工藝參數(shù)預(yù)測(cè)響應(yīng)值的一種統(tǒng)計(jì)方法。響應(yīng)面分析法目前已成為降低成本、優(yōu)化加工條件的一種有效方法，廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)等領(lǐng)域[9]。因此，本文在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以粗多糖得率為考察指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法對(duì)玫瑰茄粗多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察了其抗氧化活性，以期為玫瑰茄多糖的進(jìn)一步研究、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰茄采自江蘇省丹陽(yáng)市，經(jīng)鎮(zhèn)江食品藥品監(jiān)督管理局鑒定為錦葵科(Malvaceae)木槿屬(Hibiscus)玫瑰茄(HibiscussabdariffaL.)；恒溫電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒儀器有限公司)；數(shù)控恒溫水浴鍋(常州華冠儀器制造有限公司)；R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士Büchi公司)；UV2501紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(島津儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原料預(yù)處理 取石油醚，將粉碎的玫瑰茄干花萼反復(fù)回流脫脂，抽濾，室溫晾干。向脫脂后的玫瑰茄花萼粉末中加入3倍體積的75%乙醇浸泡過(guò)夜，以除去黃酮、色素、單糖等小分子物質(zhì)。抽濾，晾干，得到預(yù)處理后的玫瑰茄粉末，備用。

1.2.2玫瑰茄粗多糖的提取 采用水提醇沉法提取玫瑰茄粗多糖。稱取預(yù)處理后的玫瑰茄粉末5 g，置于圓底燒瓶中，按一定料液比、水浴溫度、浸提時(shí)間在熱水浴中回流浸提數(shù)次，冷卻后將所得水提液抽濾，去除雜質(zhì)，合并上清液，上清液經(jīng)減壓濃縮，按張斌濤等[10]的方法除去蛋白后，加入一定量無(wú)水乙醇至終濃度為80%，充分?jǐn)嚢?，放?℃冰箱，靜置12 h，3 000 r/min離心10 min，收集沉淀；蒸餾水復(fù)溶，于透析袋中(截留分子量3 500 Da)透析72 h，透析后的樣品經(jīng)冷凍干燥，即得玫瑰茄粗多糖。由以下公式計(jì)算多糖得率(Y)：

粗多糖得率(Y)= 粗多糖質(zhì)量(g)/樣品質(zhì)量(g)×100%

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn) ①料液比單因素實(shí)驗(yàn)。設(shè)定固定提取時(shí)間為3 h，溫度為90℃，設(shè)計(jì)料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30(g/mL)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定料液比對(duì)玫瑰茄粗多糖得率的影響。②提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)。 設(shè)定固定料液比為1∶25(g/mL)，提取溫度為90℃，分別提取1 h、2 h、3 h、4 h和5 h，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定不同提取時(shí)間對(duì)玫瑰茄粗多糖得率的影響。③提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)。 設(shè)定固定料液比1∶25(g/mL)，提取時(shí)間為3 h，分別在60℃、70℃、80℃、90℃和100℃提取，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定不同提取溫度對(duì)玫瑰茄粗多糖得率的影響。

1.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化玫瑰茄粗多糖的提取工藝 根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法對(duì)玫瑰茄中粗多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology.

1.2.5玫瑰茄粗多糖清除自由基能力的測(cè)定

①對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定。取玫瑰茄粗多糖，分別配制濃度為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL、1.4 mg/mL、1.6 mg/mL、1.8 mg/mL和2.0 mg/mL的多糖樣品。取不同濃度的多糖樣品1 mL和0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液2 mL，混勻，暗處反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光度值(Ai)，用蒸餾水替代樣品測(cè)得的吸光度值作為A0，用乙醇替代DPPH-乙醇溶液測(cè)得的吸光度值作為Aj，按以下公式計(jì)算玫瑰茄粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除率[11]。同時(shí)以抗壞血酸(Vc)作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次，求平均值。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

②對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定。取9 mmol/L硫酸亞鐵1 mL，加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，加入不同濃度(0.2～2.0 mg/mL)的多糖樣品1 mL，加入8.8 mmol/L的H2O21 mL，搖勻，在37℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光光度值(Ai)，用蒸餾水替代樣品測(cè)得的吸光度值作為A0，用蒸餾水替代H2O2測(cè)得的吸光度值作為Aj，按以下公式計(jì)算玫瑰茄粗多糖對(duì)羥基自由基的清除率[12]。同時(shí)以抗壞血酸(Vc)作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次，求平均值。

羥基自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

③對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定。取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.5mL，25℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入不同濃度(0.2～2.0 mg/mL)的多糖樣品1.0 mL和0.4 mmol/L的鄰苯三酚1.0 mL，混勻后于25℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)5 min，然后立即滴加2滴8 mol/L HCl終止反應(yīng)，并在波長(zhǎng)為325 nm處測(cè)定吸光光度值(Ai)，用蒸餾水替代樣品測(cè)得的吸光度值作為A0，用蒸餾水替代鄰苯三酚測(cè)得的吸光度值作為Aj，按以下公式計(jì)算玫瑰茄粗多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率[13]。同時(shí)以抗壞血酸(Vc)作為陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次，求平均值。

超氧陰離子自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，單因素方差分析組間差異的顯著性，結(jié)果采用 Mean±SD 表示，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各單因素對(duì)玫瑰茄粗多糖得率的影響

2.1.1料液比的影響 圖1為浸提溫度為90℃，浸提時(shí)間3 h時(shí)，料液比對(duì)玫瑰茄粗多糖得率的影響。在料液比低于1∶25時(shí)，玫瑰茄粗多糖的得率隨料液比的增大而增加。在料液比為1∶25(g/mL)時(shí)多糖得率達(dá)到最高值，但料液比超過(guò)1∶25(g/mL)后，多糖的得率略有下降。其可能的原因是溶劑水的用量較小時(shí)，原料中的多糖不能夠充分轉(zhuǎn)移到水中，造成提取不完全、得率較低，水用量過(guò)大時(shí)，多糖溶出量已達(dá)到飽和，初始加水量過(guò)大會(huì)使后續(xù)濃縮工序能耗增加，因此最優(yōu)料液比選擇1∶25(g/mL)為宜。

圖1 料液比對(duì)粗多糖得率的影響Fig.1 Effect of solid-liqiud ratio on the yield of polysaccharide.

2.1.2提取時(shí)間的影響 圖2為料液比1∶25(g/mL)，提取溫度90℃時(shí)提取時(shí)間對(duì)玫瑰茄粗多糖得率的影響。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)玫瑰茄粗多糖得率不斷增加，多糖得率在提取時(shí)間3 h時(shí)達(dá)到最大，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)得率有所下降，因此，確定提取時(shí)間為3 h。

2.1.3提取溫度的影響 圖3為料液比1∶25，提取時(shí)間為3 h時(shí)，提取溫度對(duì)玫瑰茄粗多糖得率的影響。在60～90℃溫度范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，玫瑰茄粗多糖得率逐漸增加，繼續(xù)升溫到100℃，多糖得率略有下降。因此，選擇提取溫度為90℃。

圖2 提取時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharide.

圖3 提取溫度對(duì)粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharide.

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化玫瑰茄粗多糖提取工藝

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析 根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)17個(gè)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)1～12為析因?qū)嶒?yàn)，13～17為中心實(shí)驗(yàn)。采用Design-Expert V 8.0.6軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，一次項(xiàng)X1、X3和交互項(xiàng)X1X2對(duì)玫瑰茄粗多糖的提取得率有顯著影響，一次項(xiàng)X2和二次項(xiàng)X12、X22、X32和交互項(xiàng)X1X3、X2X3對(duì)玫瑰茄粗多糖的提取得率影響極顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表2 響應(yīng)面分析因素設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design with experimental results.

Y=14.44+0.087X1+0.16X2+0.097X3-0.12X1X2-0.17X1X3-0.54X2X3-0.29X12-0.56X22-0.61X32。

2.2.2響應(yīng)面圖分析 圖4(彩圖見(jiàn)圖版七)為各個(gè)因子交互作用的響應(yīng)面三維圖和等高線分析圖。等高線圖直觀地反映出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著[14]。由圖4A、B可知，當(dāng)提取溫度為90℃時(shí)，玫瑰茄粗多糖得率隨料液比和提取時(shí)間的變化而變化，其變化幅度和曲線坡度均較大，可見(jiàn)料液比與提取時(shí)間兩個(gè)因素對(duì)多糖得率存在著較強(qiáng)的交互作用。當(dāng)固定提取時(shí)間為3 h時(shí)，由圖4C、D可見(jiàn)：提取溫度曲線急劇變化，可見(jiàn)提取溫度對(duì)玫瑰茄粗多糖得率的影響較大，同時(shí)等高線也呈橢圓形，說(shuō)明提取溫度和料液比兩個(gè)因素間的交互作用也較大。當(dāng)固定料液比為1∶25時(shí)，提取溫度和提取時(shí)間兩個(gè)因素也存在顯著的交互影響，當(dāng)溫度從80℃增加至90.04℃時(shí)，玫瑰茄粗多糖得率隨之顯著提高，而后當(dāng)溫度繼續(xù)升高，得率有所下降，這表明玫瑰茄粗多糖得率達(dá)到最大值時(shí)，溫度為90.04℃(圖4E、F)。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance and result.

注:*表示P<0.05水平差異顯著；**表示P<0.01水平差異顯著。

2.3 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證

通過(guò)響應(yīng)面法預(yù)測(cè)玫瑰茄粗多糖最優(yōu)的提取工藝條件為最大響應(yīng)值(Y)時(shí)，X1、X2、X3對(duì)應(yīng)的編碼值分別為：A=0.123、B=0.129、C=0.004，與其相對(duì)應(yīng)的多糖的最佳提取條件是：1∶25.62(g/mL)、時(shí)間3.13 h、溫度90.04℃，理論最佳提取率是14.46%。考慮到實(shí)際情況對(duì)上述條件進(jìn)行修正，最終的優(yōu)化條件調(diào)整為液料比1∶26(g/mL)、提取時(shí)間3.1 h、提取溫度90℃，在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，提取得率為14.41%，與理論預(yù)測(cè)值較接近，說(shuō)明該響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型準(zhǔn)確可靠，適用于玫瑰茄粗多糖的提取。

2.4 玫瑰茄粗多糖對(duì)自由基的清除作用

2.4.1對(duì)DPPH自由基的清除作用 DPPH自由基被認(rèn)為是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若樣品可以將其清除，則表明該樣品具有抗氧化活性。DPPH有單電子，在517 nm有最大吸收，其乙醇溶液呈深紫色，當(dāng)樣品具有抗氧化活性時(shí)，它能與DPPH的單電子配對(duì)，從而使DPPH-乙醇溶液顏色變淺，其褪色程度與樣品清除自由基效率呈線性關(guān)系，因而可用此方法評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力[15]。由圖5可知，玫瑰茄粗多糖對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用。當(dāng)多糖濃度從0.2 mg/mL 升到2.0 mg/mL時(shí)，隨著多糖濃度的升高，對(duì)DPPH的清除作用也逐漸加強(qiáng)，當(dāng)玫瑰茄粗多糖濃度為2 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)到45.89%。

2.4.2對(duì)羥基自由基的清除作用 羥基是一種活性氧自由基，毒性極強(qiáng)，可造成生物膜損傷，導(dǎo)致多種疾病發(fā)生，清除體內(nèi)羥基自由基是保證機(jī)體健康必不可少的需求[16]。

由圖6可知玫瑰茄粗多糖對(duì)羥基自由基的清除作用與多糖的濃度成正相關(guān)，當(dāng)多糖濃度為0.2 mg/mL 時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)10.23%，當(dāng)多糖濃度為2 mg/mL 時(shí)，對(duì)羥基自由基的清除率可達(dá)61.42%，隨著玫瑰茄粗多糖濃度的增加，對(duì)羥基自由基的清除率也隨之升高。

圖4 液料比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)玫瑰茄粗多糖得率的響應(yīng)面(A、C、E)和等高線分析圖(B、D、F)Fig.4 Response surface(A、C、E) and contour plots (B、D、F) results of solid-liquid ratio, extraction time and extraction temperature effects on the yield of polysaccharide. (彩圖見(jiàn)圖版七)

2.4.3對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 超氧陰離子自由基是人體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性氧自由基，能引發(fā)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化，加快肌體的衰老，誘發(fā)癌癥、心血管疾病，嚴(yán)重危害人體健康[17]。玫瑰茄粗多糖對(duì)超氧陰離子自由基具有一定的清除作用，如圖7所示，隨著粗多糖濃度的增加，清除作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)多糖濃度為2 mg/mL 時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到81.42%。

圖5 玫瑰茄粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effect of polysaccharide on DPPH free radical.

圖6 玫瑰茄粗多糖對(duì)羥基自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccharide on hydroxyl free radical.

圖7 玫瑰茄粗多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effect of polysaccharide on superoxidant free radical.

3 討論

張文莉[18]采用水提醇沉法提取玫瑰茄干花萼中的粗多糖，提取得率為9.78%；Müller等[19]也采用該法提取玫瑰茄粗多糖，但多糖得率僅為5.3%。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化玫瑰茄粗多糖的提取工藝條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)液料比1∶26(g/mL)、提取時(shí)間3.1 h、提取溫度90℃時(shí)，粗多糖的實(shí)際提取得率達(dá)到14.41%，該工藝條件提升了水提醇沉法提取玫瑰茄粗多糖的產(chǎn)量。響應(yīng)面分析法作為試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化方法，它是將體系的響應(yīng)值作為一個(gè)或多個(gè)因素的函數(shù)，運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來(lái)，此方法不僅能全面地展示不同因素對(duì)響應(yīng)值的影響，而且能分析各因素間的交互作用，從而有利于提取工藝的優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化玫瑰茄干花萼中粗多糖的提取工藝，玫瑰茄粗多糖的實(shí)際得率與模型中預(yù)測(cè)得率誤差小，說(shuō)明該方法合理可行，優(yōu)化的工藝條件可用于玫瑰茄粗多糖的提取。

自由基是指具有不成對(duì)電子的原子或基團(tuán)，它們普遍存在于人體內(nèi)。一定數(shù)量的自由基對(duì)人體是有益的，它們既可以參與免疫和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，又可以用來(lái)殺滅體內(nèi)的細(xì)菌和寄生蟲(chóng)。但是當(dāng)人體內(nèi)的自由基超過(guò)一定數(shù)量，便會(huì)失去控制，導(dǎo)致人體正常細(xì)胞和組織的損壞，從而引起多種疾病，因此開(kāi)發(fā)高效無(wú)毒的天然抗氧化劑作為自由基清除劑，清除體內(nèi)多余自由基從而預(yù)防和治療某些疾病，已成為當(dāng)今科學(xué)研究的熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)玫瑰茄粗多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基都具有清除作用，清除率分別為45.89%、61.42%、81.42%，這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)制備的玫瑰茄粗多糖具有抗氧化作用，可以作為潛在的自由基清除劑。然而本研究只在體外對(duì)3種自由基的清除效果進(jìn)行了研究，在生物體內(nèi)玫瑰茄粗多糖是否具有抗氧化作用還有待于進(jìn)一步研究。

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