李云貴 李天平 鄒柳

燈盞花素（breviscapine）又稱燈盞細(xì)辛，是菊科植物短葶飛蓬的干燥全草，其中主要成分為燈盞花乙素（即野黃芩苷），另含少量燈盞花甲素，其中燈盞花乙素含量達(dá)95﹪以上，為燈盞花素的主要有效成分[1]。燈盞花素具有改善心腦微循環(huán)、增加血流量、抗氧化、抗炎及拮抗心肌缺血再灌注損傷等藥理作用[2～6]，其中最顯著的作用是保護(hù)心腦血管[7]。目前上市的燈盞花素制劑中存在生物利用度低、體內(nèi)消除迅速、半衰期短等缺點(diǎn)。本研究以實(shí)驗(yàn)室自制燈盞花素TPGS聚合物膠束（Bre/TPGS）為研究對(duì)象，采用高效液相色譜法測(cè)定燈盞花素TPGS聚合物膠束在大鼠體內(nèi)的血藥濃度變化過(guò)程，用3P97藥動(dòng)學(xué)軟件對(duì)血藥濃度進(jìn)行分析并計(jì)算其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)[8～13]；同時(shí)采用燈盞花素TPGS聚合物膠束對(duì)FeCl3誘導(dǎo)大鼠頸動(dòng)脈血栓溶解作用進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠32只，體質(zhì)量200～250g，雌雄各半，南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2015-0002。

1.2 藥品與試劑 燈盞花素原料藥（批號(hào)：HB20121102，湖南恒生制藥有限公司）；燈盞花素膠束（實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20170305）；燈盞花素粉針劑（批號(hào)：15150504，湖南恒生制藥有限公司）；蘆?。ㄅ?hào)：201610，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所）；肝素鈉（規(guī)格：2ml∶1.25萬(wàn)U，批號(hào)：20161120）；燈盞花乙素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所）；其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent Technologies）；Y-1型渦旋振蕩器（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；pH計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；5810R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；SY-1220恒溫水浴槽（美國(guó)精琪公司）；移液槍（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.4 建立HPLC測(cè)定體內(nèi)分析

1.4.1 色譜條件 色譜柱：月旭 C18柱（250mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1﹪ 磷酸水，pH 3.0（27：73，v/v）；流速：0.7ml/min；UV 檢測(cè)波長(zhǎng)：335nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μl。

1.4.2 血漿樣品的預(yù)處理 精密吸取100μl大鼠血漿樣品，加入20μl蘆丁內(nèi)標(biāo)液（100μg/ml），渦旋混和，加 入 20μl磷 酸（1mol/L），20μl EDTA-2Na（2g/L），0.5ml甲醇，渦旋混和5min，離心5min（10 000r/min），分離上清液于另一只1.5ml EP離心管中，下層沉淀再加入0.5ml甲醇，渦旋混和5min，離心5min（10 000r/min），分離上清液，合并兩次上清液，置于37℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘留物加?00μl甲醇溶解并混勻，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，取20μl樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

1.4.3 方法專屬性考察 空白血漿樣品：采用移液槍吸取100μl大鼠空白血漿，按1.4.2項(xiàng)方法處理樣品，其中不加蘆丁內(nèi)標(biāo)液。燈盞花乙素空白血漿樣品：采用移液槍吸取100μl大鼠空白血漿，加一定濃度的燈盞花乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4.2項(xiàng)方法處理樣品，其中不加蘆丁內(nèi)標(biāo)液。給藥后的血漿樣品加內(nèi)標(biāo)蘆?。翰捎靡埔簶屛?00μl給藥后的血漿樣品，按1.4.2項(xiàng)方法處理樣品。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用移液槍吸取數(shù)份100 μl大鼠空白血漿，加入20μl不同濃度的燈盞花乙素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成燈盞花乙素濃度分別為 0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40μg/ml的血漿樣品，每一濃度配制3份樣品，按1.4.2項(xiàng)方法處理樣品，以藥物濃度（C）為橫坐標(biāo)，以燈盞花乙素與蘆丁內(nèi)標(biāo)峰面積比（As/Ai）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.5 回收率試驗(yàn)

1.4.5.1 方法回收率 采用移液槍吸取3份大鼠空白血漿各100μl，加入一定量的燈盞花乙素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別制成低（0.1μg/ml）、中（5μg/ml）、高（30μg/ml）3種不同濃度的燈盞花素血漿樣品，每一濃度設(shè)置3個(gè)平行組，按1.4.2 項(xiàng)方法處理樣品，根據(jù) 1.4.4 所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)際藥物濃度，可得出其方法回收率，即實(shí)際濃度/理論濃度×100﹪。

1.4.5.2 提取回收率 精密吸取3份大鼠空白血漿各100μl，加入一定量的燈盞花乙素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別制成低（0.1μg/ml）、中（5μg/ml）、高（30μg/ml）3 種不同濃度的燈盞花素血漿樣品，每一濃度設(shè)置3個(gè)平行組，按1.4.2 項(xiàng)方法處理樣品，測(cè)定燈盞花素峰面積（A1）；分別配制低（0.1μg/ml）、中（5μg/ml）、高（30μg/ml）3種不同濃度的燈盞花乙素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，HPLC測(cè)定峰面積（A2），可得出其提取回收率，即A1/A2×100﹪。

1.4.6 精密度實(shí)驗(yàn) 分別配制低、中、高3種不同濃度的燈盞花乙素血漿樣品，每一濃度設(shè)置3個(gè)平行組，按1.4.2項(xiàng)方法處理樣品。以一天中測(cè)5次，觀察其日內(nèi)精密度，計(jì)算RSD。同法，用上述樣品每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定3 d，觀察其日間精密度，計(jì)算RSD。

1.4.7 血漿樣品的穩(wěn)定性 制備多份濃度為30.0μg/ml的燈盞花素血漿樣品，分為兩組，一組用磷酸（1mol/L）調(diào)pH至3.0左右，另一組不加磷酸調(diào) pH。每一組又分成兩小組，樣品分別保存在室溫和-20℃冰箱中，在安排的時(shí)間點(diǎn)取出樣品，按1.4.2項(xiàng)方法處理樣品，測(cè)定樣品中燈盞花乙素含量。

1.5 尾靜脈注射藥物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)研究

1.5.1 給藥方案與樣品采集 取SD 大鼠 12只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250g。隨機(jī)分為兩組，給藥前禁食12h，自由飲水。分別尾靜脈注射燈盞花素粉針劑（對(duì)照組）以及Bre/TPGS（Bre/TPGS組），給藥劑量均為10mg/kg（以燈盞花素溶度計(jì)算），于給藥后3min、10min、30min、45min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、12h、24h和48h，經(jīng)大鼠眼眶靜脈叢取血約0.5ml，放入預(yù)先加肝素鈉抗凝的1.5ml EP中，以4 000r/min離心10min，離心后馬上取上層血漿，放到-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫?.4.2項(xiàng)方法進(jìn)行處理測(cè)定。

1.5.2 數(shù)據(jù)處理 繪制Bre/TPGS的血藥濃度-時(shí)間曲線，采用3P97藥代動(dòng)力學(xué)軟件，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

1.6 尾靜脈注射藥物體內(nèi)藥效學(xué)研究

1.6.1 大鼠尾靜脈注射給藥 大鼠在自然光條件下于溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度（75±5）﹪環(huán)境中飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，每組4 只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)分組：①模型組（n=4）：給生理鹽水1ml/100g；②市售燈盞花素粉針劑組：給市售藥1ml/100g（相當(dāng)于燈盞花素1 mg/kg）；③低劑量膠束組：給膠束藥1ml/100g （相當(dāng)于燈盞花素0.5mg/kg）；④中劑量膠束組：給膠束藥1ml/100g（相當(dāng)于燈盞花素1mg/kg）；⑤高劑量膠束組：給膠束藥1ml/100g （相當(dāng)于燈盞花素2mg/kg）。

1.6.2 用35﹪FeCl3建立頸動(dòng)脈血栓模型 5組大鼠于造模前12h禁食不禁水，1﹪戊巴比妥鈉麻醉（5 ml/kg），分離大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈2cm，其下放置塑料薄膜（4cm×2cm），其目的是保護(hù)血管周圍組織，將吸有35﹪FeCl3溶液的小片濾紙（1cm×1cm）敷于右側(cè)頸總動(dòng)脈上，30min后去除紙片，生理鹽水清洗后縫合傷口。待大鼠清醒后連續(xù)尾靜脈注射給藥3d，再將大鼠麻醉，取出左側(cè)血栓，并在右側(cè)取與血栓相同長(zhǎng)度的一段正常血管，放于甲醇溶液中固定，于60℃烤箱烘干2h，以電子分析天平秤其血栓的重量，計(jì)算給藥組的溶栓率。血栓重量＝血栓與血管壁的總重量-同樣長(zhǎng)度血管壁重量。溶栓率=（模型組血栓重量－藥物組血栓重量） / 模型組血栓重量×100﹪。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，顯著性檢驗(yàn)采用組間t或χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性 按1.4.2項(xiàng)方法處理各樣品，結(jié)果見圖1～3。在此色譜條件下，燈盞花素的出峰時(shí)間約6.8min，且與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.5，內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾。表明在該條件下，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不會(huì)影響燈盞花素的檢測(cè)，其方法符合體內(nèi)藥物含量測(cè)定要求。

圖1 大鼠空白血漿樣品HPLC圖

圖2 燈盞花素空白血漿HPLC圖

圖3 給藥后血漿+蘆丁的HPLC圖

2.2 血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線 按1.4.2項(xiàng)方法處理，配置一系列濃度的樣品，測(cè)定其燈盞花乙素峰面積（As）與蘆丁內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai），計(jì)算 As/Ai，各濃度樣品數(shù)據(jù)結(jié)果為 0.151、0.163、0.254、0.386、1.426、2.824、4.502、7.274、9.071，標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制圖見圖4。其標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程式為y=0.2282x+0.1401，R2=0.9956。結(jié)果表明，燈盞花素濃度在0.05～40μg/ml范圍內(nèi)峰面積線性關(guān)系良好，滿足測(cè)定要求。

圖4 燈盞花素在大鼠血漿中標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 回收率實(shí)驗(yàn) 燈盞花素血漿中方法回收率和提取回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，回收率滿足生物樣品的分析測(cè)定要求。

表1 燈盞花素提取回收率和方法回收率（﹪）

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 燈盞花素血漿中日內(nèi)與日間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。樣品精密度良好，RSD＜15﹪，滿足生物樣品的分析測(cè)定要求。

表2 燈盞花素日間、日內(nèi)精密度測(cè)定結(jié)果（﹪）

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 血漿樣品的穩(wěn)定性結(jié)果見表3、4。結(jié)果表明，當(dāng)血漿樣品用磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.0時(shí)，其在-20℃條件下與室溫下樣品的穩(wěn)定性均較好。未用磷酸調(diào)節(jié)的血漿樣品在室溫下不穩(wěn)定，降解比較快。血漿樣品在-20℃條件下，磷酸調(diào)節(jié)pH與未調(diào)節(jié)pH穩(wěn)定性無(wú)明顯差異?？紤]血漿樣品需要長(zhǎng)時(shí)間存放，并且需要在室溫下解凍，所以樣品用磷酸調(diào)節(jié) pH 后再冷凍保存更好。

表3 磷酸調(diào)節(jié)的燈盞花素血漿樣品穩(wěn)定性（﹪）

表4 未用磷酸調(diào)節(jié)的燈盞花素血漿樣品穩(wěn)定性（﹪）

2.6 大鼠尾靜脈注射給藥后血藥濃度 尾靜脈注射市售燈盞花素粉針劑與Bre/TPGS后，HPLC法測(cè)定血漿樣品濃度，繪制血藥濃度-時(shí)間曲線見圖5。市售燈盞花素粉針劑組藥物在大鼠體內(nèi)4h已經(jīng)檢測(cè)不到燈盞花乙素，而Bre/TPGS在24h還能檢測(cè)到藥物，Bre/TPGS能明顯改善其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為。從表5中可知，在同等給藥劑量下，市售燈盞花素粉針劑組和 Bre/TPGS 組的 T1/2、AUC0-t、MRT0-t均存在顯著性差異（P＜0.05）。

圖5 大鼠血漿中燈盞花素濃度-時(shí)間曲線圖注：A為注射后24h；B為注射后4h；n=6

表5 尾靜脈注射給藥后大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.7 大鼠尾靜脈注射給藥后血栓療效 各藥物組血栓實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果見表6，結(jié)果表明，與模型組相比，各藥物組血栓重量都有不同程度的減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且低、中、高劑量膠束組溶栓作用呈濃度依賴性。中、高劑量膠束組與燈盞花素粉針劑組相比較，膠束組血栓重量明顯減少，血栓溶栓率也明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。燈盞花素粉針劑組及低劑量膠束組血栓干重下降，但兩者比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。表明將燈盞花素制成聚合物膠束可提高藥物的溶栓作用。

表6 不同組血栓的比較（±s，n=4）

表6 不同組血栓的比較（±s，n=4）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與燈盞花素粉針劑組比較，△P＜0.05

分組 劑量（mg/kg） 干重（mg） 溶栓率（﹪）模型組 - 3.675±0.54 -燈盞花素粉針劑組 1.0 2.850±0.17* 22.45±4.71低劑量膠束組 0.5 2.875±0.15* 21.76±4.07中劑量膠束組 1.0 2.525±0.27*△ 31.29±3.41△高劑量膠束組 2.0 2.325±0.17*△ 36.73±4.60△

3 討論

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)生活水平的提高，居民的生活方式發(fā)生很大變化，如缺乏鍛煉、吸煙飲酒、膳食結(jié)構(gòu)不平衡及工作生活壓力增大等，這些與行為密切相關(guān)的心血管疾病危險(xiǎn)因素水平呈增高趨勢(shì)，缺血性心腦血管病發(fā)病率也逐年上升[2]。缺血性心腦血管病發(fā)病原因是心腦血管急性血流障礙所引起的突發(fā)性局部性功能障礙。對(duì)于血栓性疾病的預(yù)防和治療，需要研究探討血栓形成的生理病理機(jī)制，而良好的動(dòng)物血栓模型對(duì)這些機(jī)制研究具有尤為關(guān)鍵的作用。

大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為結(jié)果表明，與市售燈盞花素粉針劑相比較，Bre/TPGS在血液循環(huán)中消除速度相對(duì)緩慢，T1/2為前者的12.8倍左右。由于Bre/TPGS粒徑較小且被PEG鏈形成的水化物理屏障層所保護(hù)，能夠讓膠束不容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）識(shí)別及吞噬或被肝臟、脾臟等組織排泄，延長(zhǎng)藥物體內(nèi)循環(huán)時(shí)間并保持穩(wěn)定，使藥物在血液循環(huán)中具有較長(zhǎng)的滯留時(shí)間。因此，與燈盞花素粉針劑相比，載藥膠束具有更好的藥動(dòng)學(xué)行為，表現(xiàn)出顯著增加的T1/2、MRT和AUC，從而提高燈盞花素的治療效果；并具有促進(jìn)血栓溶解作用，在相同劑量下，Bre/TPGS溶解血栓效果優(yōu)于市場(chǎng)銷售的燈盞花素粉針劑。

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