潘 登，顏曉勇

(1.中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，廣東 東莞 523000；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 腎病風(fēng)濕科，貴州 遵義 563099)

糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥及死亡原因之一。最近研究證明，炎性反應(yīng)在DN的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[1-2]。CD26是一種分布于內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞及T細胞等多種細胞的跨膜糖蛋白[3]，其可與甘露糖結(jié)合凝集素(Mannan binding lectin，MBL)相結(jié)合[4-5]，與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。本實驗通過檢測高糖刺激下體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的CD26、MBL、C3、MAC及IL-6和NF-kB的表達，探討CD26對人臍靜脈內(nèi)皮細胞MBL補體途徑及微炎癥狀態(tài)的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(ATCC，美國)，低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，兔抗人CD26多克隆抗體(ab28340)，兔抗人MBL單克隆抗體(ab133629)，兔抗人C5b-9多克隆抗體(ab55811)，兔抗人C3多克隆抗體(ab97462)(Abcam公司，美國)，人CD26引物，人IL-6引物，人NF-kB引物(四川生工科技有限公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司，大連)等。

1.2 主要儀器 超凈工作臺(蘇州凈化有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，離心機(Eppendorf，德國)，高壓蒸汽滅菌器(SANYO，日本)，pH滴定儀(Jenway，美國)，酶標(biāo)儀(LISTEO，美國)，Realtime PCR擴增儀(Biorad，美國)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 對照組(加入葡萄糖5.5 mmol/L)；高滲組(加入葡萄糖5.5 mmol/L和甘露醇24.5 mmol/L)；高糖組(加入葡萄糖30 mmol/L)。

1.3.2 免疫組化法檢測細胞的CD26、MBL、C3和MAC的表達 將分組培養(yǎng)的細胞加入4%多聚甲醛固定30 min，設(shè)PBS組為陰性對照，加入一抗(CD26 1∶200、MBL 1∶100、C3 1∶100、MAC 1∶200)，孵育24 h，復(fù)溫，吸走一抗，加入1∶200的組化二抗，37 ℃孵育30 min后，顯色，返藍，封片劑封片。于顯微鏡下觀察各組蛋白表達。

1.3.3 Western Blot檢測HUVEC的CD26、MBL、C3及MAC的蛋白水平量 將分組培養(yǎng)的細胞離心后加入裂解液、酶抑制劑及蛋白抽提試劑，離心取上清。用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，制作標(biāo)準曲線，并根據(jù)OD值計算待測樣品蛋白濃度。配膠、轉(zhuǎn)膜，以GAPDH為內(nèi)參，加入一抗(CD26 1∶1 000、MBL 1∶1 000、C3 1∶2 000、MAC 1∶200)，后用TBST清洗加入二抗室溫孵育2 h。用化學(xué)發(fā)光法顯影，并用Image J圖像分析軟件行灰度值分析。

1.3.4 qRT-PCR檢測細胞中CD26、IL-6和NF-kB mRNA表達 將分組培養(yǎng)的細胞離心分離后，加入Trizol裂解細胞，后移至EP管中，靜置后離心，取上清加0.5 mL異丙醇混勻離心，加1 mL預(yù)冷的75%乙醇震蕩后，離心棄上清，加0.1%DEPC水50 μL吹打至溶解，提取總RNA，配制qRT-PCR的反應(yīng)體系，擴增目標(biāo)基因。qRT-PCR引物序列見表1。反應(yīng)條件：第1步：95 ℃預(yù)變性2 min；第2步：95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s；第3步：72 ℃延伸1 min， 40個循環(huán)。以Ct值為統(tǒng)計參數(shù)，按2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達情況。

表1 qRT-PCR引物序列

GeneSequenceIDForwardprimerReverseprimerCD26NM_001935.3AAGTGGCGTGTTCAAGTGTTCTTCTGGAGTTGGGAGACIL-6NM_000600.3CTTCGGTCCAGTTGCCTTCTGTGAGTGGCTGTCTGTGTGNF-kBNM_001165412.1CTGAGTCCTGCTCCTTCCAACTTCGGTGTAGCCCATTTGTβ-actinNM_001101.3TGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAG

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法及Western Blot檢測HUVEC的CD26、MBL、C3、MAC的蛋白表達 在HUVEC中CD26、MBL、C3、MAC主要表達于胞膜和胞漿，見圖1。與對照組及高滲組相比，高糖組CD26、MBL、C3及MAC的蛋白相對表達量均明顯增高(P<0.05，見圖2，表2)。

A:CD26;B:MBL;C:C3;D:MAC。圖1 各指標(biāo)的免疫組化表達(200×)

圖2 各組各指標(biāo)的蛋白印跡圖

組別蛋白表達量CD26MBLC3MAC對照0.71±0.090.56±0.120.71±0.060.45±0.05高滲0.59±0.030.78±0.090.81±0.090.54±0.09高糖1.20±0.05■▼1.22±0.03■▽1.19±0.05■▼0.78±0.04■▽

與對照組比較：■P<0.01；與高滲組比較：▽P<0.05，▼P<0.01。

2.2 qRT-PCR檢測HUVEC的CD26、IL-6和NF-kB mRNA表達 與對照組及高滲組相比，高糖組CD26、IL-6、NF-kB的mRNA相對表達量均增加(P<0.05，見表3)。

組別mRNA的表達量CD26IL-6NF-kB對照0.40±0.080.08±0.052.81±1.03高滲0.25±0.060.05±0.062.09±0.79高糖0.78±0.15□▼0.25±0.10□▼11.97±2.02□▽

與對照組比較：□P<0.05；與高滲組比較：▽P<0.05，▼P<0.01。

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1 CD26 Western Blot蛋白表達量與MBL呈正相關(guān)(r=0.825，P<0.01)；與C3呈正相關(guān)(r=0.869，P<0.01)；與MAC亦呈正相關(guān)(r=0.828，P<0.01)。

2.3.2 CD26的qRT-PCR mRNA相對表達量與IL-6呈正相關(guān)(r=0.858，P<0.01)；與NF-kB亦呈正相關(guān)(r=0.794，P<0.05)。

3 討論

DN是終末期腎病的主要病因及死亡原因之一[7]，是多種發(fā)病機制綜合作用的結(jié)果。因此，研究DN的發(fā)生發(fā)展機制及其相關(guān)治療方案，將為人類的健康帶來巨大收益。CD26作為一種重要的促炎細胞因子可以與MBL相結(jié)合，進而激活甘露糖結(jié)合凝集素補體途徑[8]，介導(dǎo)相關(guān)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，進而引起腎臟細胞及組織的損傷[9]。

本實驗免疫組化結(jié)果顯示：在HUVEC中CD26、MBL、C3、MAC主要表達于胞膜和胞漿。Western Blot結(jié)果顯示：與對照組及高滲組相比較，高糖組人臍靜脈內(nèi)皮細胞CD26、MBL、C3、MAC的蛋白表達量是升高的(P<0.05)，而對照組與高滲組相比較，各指標(biāo)蛋白表達量均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，CD26分別與MBL、C3、MAC蛋白表達量呈明顯正相關(guān)(P值均<0.01)。由此可以看出，高糖條件下，HUVEC的CD26表達增高，其作為MBL的配體與其相結(jié)合，激活甘露糖結(jié)合凝集素補體途徑，進而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起細胞及組織的損傷。

qRT-PCR結(jié)果顯示：與對照組及高滲組相比較，高糖組HUVEC中CD26、IL-6、NF-kB的mRNA表達量是升高的(P<0.05)；對照組與高滲組相比較，各指標(biāo)mRNA的相對表達量均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。且CD26分別與IL-6、NF-kB的mRNA表達量呈正相關(guān)(P值均<0.05)。由此我們可以得出：高糖作用下，細胞的CD26、IL-6、NF-kB mRNA的相對表達量是增加的，CD26除了通過激活MBL補體途徑，促進和擴大后續(xù)炎癥反應(yīng)外，也可能通過直接作用于致炎因子IL-6及NF-kB，從而加重炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起腎組織的損傷。

本實驗研究了高糖作用下的HUVEC中MBL補體激活途徑對細胞炎癥反應(yīng)的影響及其作用機制。而CD26作為一個具備免疫調(diào)節(jié)作用的粘附分子，在此炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)著重要地位。人臍靜脈內(nèi)皮細胞在高糖作用下細胞內(nèi)的CD26的表達量是升高的。而大量的CD26可通過激活細胞內(nèi)的甘露糖結(jié)合凝集素補體途徑，介導(dǎo)炎癥因子IL-6、NF-kB的產(chǎn)生。另外，CD26還有可能通過作用于內(nèi)肽酶Meprin β及高遷移率族蛋白1等多種蛋白[10-11]，使細胞中炎癥因子IL-6及NF-kB的表達增加，加重DN者的組織損傷。目前，CD26對DN炎癥狀態(tài)的影響及作用機制還有待于進一步研究。

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