吳筱琴，鐘 聲，孫 鍇，黃孫峰，張 怡，欣 堅，崔 立

(1.上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 200240； 2.上海羅氏創(chuàng)新中心，上海 201203)

小鼠體型小，生長繁殖快，成本低，易于操作和控制，是醫(yī)學實驗尤其是藥代動力學實驗常用動物。在各種動物實驗研究中，為了評價藥物、新化合物等的藥理學、藥物代謝動力學特征，常在一定時間內多次采集動物血液[1]。目前，小鼠常用的采血方法有眼眶后靜脈叢采血法，眼球摘除采血法，心臟采血法，尾靜脈采血法等[2]。據研究報道，采血本身會引起動物應激，某些采血方法甚至會引起動物局部組織的嚴重損傷甚至是動物死亡[3-4]。其中，小鼠眼眶后靜脈叢采血是目前最常用的小鼠連續(xù)多次采血方法[5]，其采血量可滿足藥代、藥效等常用指標的分析。但在實際應用中，眼眶靜脈叢采血會造成動物眼睛局部的嚴重損傷、甚至是失明，采血過程中動物表現明顯痛苦，需要麻醉，且所需動物數量較大、采血量較多，因此該采血方法不完全符合動物福利3R原則。近年來，生物分析儀器靈敏度有大幅提高。以本實驗使用的三重四極桿質譜靈敏度為例，Triple Quad 5500比API 4000靈敏度提到了5～10倍。這就從技術上實現了能夠支持微量血液樣品的生物分析[6]。但目前，以微量采血進行生物分析及藥代動力學研究國內尚未見報道。而在這一研究領域，于小鼠后肢隱靜脈采血國內外均未見報道。本研究首次建立了小鼠后肢隱靜脈微量采血的新方法。該方法所需動物數量顯著減少，同時動物表現痛苦小，無需麻醉，對動物局部組織的損傷較小，并可重復采血，采血量小。與常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法比較，所獲得的主要藥代動力學參數一致，無明顯差異。因此在小鼠藥代動力學實驗中隱靜脈微量采血法完全可以替代現有的常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法，且更加符合動物福利3R原則。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性CD-1小鼠92只，6～8周齡，體重20～25 g；由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供[SCXK (滬) 2012-0002]。本實驗在上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司SPF動物房進行[SYXK (滬) 2015-0026]，動物房恒溫恒濕(溫度21℃～23℃，濕度40%～60%)，光照時間8:00～20:00。實驗開始前，小鼠在動物房中適應至少5 d。本實驗由上海羅氏創(chuàng)新中心實驗動物使用與管理委員會批準號：RICS-20150921。

1.2 主要試劑與儀器

給藥溶液的配置：靜脈注射溶液由5%(w/v)二甲基亞砜(DMSO)、40%(w/v)聚乙二醇(PEG 400)和55%(w/v)生理鹽水配制；口服溶液由2%(w/v)羥丙基纖維素、0.1%(w/v)聚山梨醇酯(polysorbate 80)和0.1%(w/v)對羥基苯甲酸甲酯的水溶液配制；色譜級乙腈、甲醇：Thermo Fisher公司；實驗所用其他試劑純度均為色譜級別。

麻醉機：Matrx公司，型號91805060；超高效液相色譜儀(UPLC-MS/MS)：Shimadzu公司，型號Nexera LC System；三重四級桿質譜儀：AB SCIEX公司，型號5500；Chromolith FastGradient RP-18 Endcapp(50×2.0 mm)色譜柱：默克公司；離心機：梅特勒公司，型號5424，Beckman公司，型號Allegra 64R；電子天平：梅特勒公司，型號XP205DR；微量采血毛細管：Sarstedt Ag & Co.公司，型號Minivette POCT；滅菌注射針及注射器：上海米沙瓦公司，型號4.5和6號；一次性抗凝管及一次性血樣采集針：江蘇康健公司；酒精棉球等。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠藥代動力學實驗設計

將92只CD-1小鼠分別隨機編號并稱重，分為16組。分別單次給予靜脈注射(intravenous injection，IV)1 mg/kg以及口服灌胃(oral gavage，PO)10 mg/kg的模型化合物A、B、C、D。

① 常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法：靜脈注射每組9只動物，口服灌胃每組8只動物；

② 后肢隱靜脈微量采血法：靜脈注射、口服灌胃每組均3只動物。具體實驗設計見表1。

1.3.2 采血時間點

靜脈給藥組：于給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、7 h、24 h采集樣品，共8個時間點。

口服給藥組：于給藥后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、7 h、24 h采集樣品，共7個時間點。

對于常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法，因采血量較大(每只各時間點150 μL)，對動物進行間隔采血，每個時間點采用3只動物，每只動物最多采集不超過3次，具體采血安排見表2。

對于隱靜脈微量采血法，采血量小(每只各時間點30 μL)，在全部3只動物中采集所有時間點的樣品。

表2 動物間隔采血安排Tab.2 Time points of blood collection

注：“√”為該采血點所使用動物。

Note. “√” indicates the animals for blood collection at that time point.

1.3.3 采血方法

(1)常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法：將小鼠放入異氟烷麻醉箱進行吸入麻醉后，左手抓緊小鼠頸部皮膚固定頭部，并輕輕向下壓迫頸部兩側，以突出小鼠眼球并使眼球充血，右手用事先準備好的一次性血樣采集針針頭頂端(針尖斜面朝內)垂直插入外眥，見針管有血液后，保持此位置連接離心管，血液便會連續(xù)不斷地滴入，當血液量達到150 μL時拔出采集針立即用滅菌干棉球壓迫止血。

(2)隱靜脈微量采血法：小鼠無需麻醉，實驗前先將小鼠后肢部位剃毛，將小鼠放入合適的固定器中，露出后肢，酒精棉球擦拭采血部位消毒后，將滅菌注射針頭迅速刺入后肢隱靜脈，血液流出，用微量采血毛細管收集30 μL血液于離心管中。采血結束，立即用滅菌干棉球壓迫止血。

1.3.4 小鼠疼痛評估

小鼠在隱靜脈微量采血過程中，根據國際NC3RS“小鼠痛苦表情評分”及遵循AAALAC《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南(第八版)》，通過觀察小鼠的表情、外貌表現(被毛、理毛行為、眼睛、軀干體姿、呼吸)、飲食和排泄、行為(合群情況、運動、性格、聲音)及臨床癥狀(心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng))評估和判定小鼠的疼痛程度。此評估僅適用于清醒動物，因常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法動物表現明顯痛苦，實施麻醉，未進行疼痛評分。

1.3.5 血漿樣品處理

(1)常規(guī)采血法血漿樣品處理：取小鼠血漿樣品20 μL，加入60 μL冰乙腈進行1∶4(v/v)蛋白沉淀，渦旋使其充分混合后在4℃條件下以12 000 r/min轉速離心10 min后，取上清液進樣到AB Sciex Triple Quad 5500 MS/MS系統(tǒng)使用電噴霧離子化模式進行分析。進樣體積均為2 μL。

(2)微量采血法血漿樣品處理：取小鼠血漿樣品5 μL，加入95 μL冰乙腈進行1∶20(v/v)蛋白沉淀，渦旋使其充分混合后在4℃條件下以12 000 r/min轉速離心10 min后，取上清液進樣到AB Sciex Triple Quad 5500 MS/MS系統(tǒng)使用電噴霧離子化模式進行分析。進樣體積均為1 μL。

1.4 數據處理

通過Phoenix軟件計算主要藥代動力學參數，包括AUC(藥時曲線下面積)、t1/2z(消除半衰期)、Cmax(峰濃度)、Tmax(達峰時間)、MRT(平均駐留時間)、CLz(清除率)和Vz(分布容積)。

2 結果

在采血過程中，通過對比NC3RS的“小鼠痛苦表情評分”以及AAALAC《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南(第八版)》，小鼠表現均為正常(所有評分項目為“0”-正常)，表明的確將動物損傷降至了最低。對于A、B、C、D四種化合物在小鼠中分別單次給藥，采用兩種采血方法計算所得的主要藥代動力學參數見表3～6，藥時曲線見圖1～4。結果表明，與常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法相比，采用隱靜脈微量采血所獲得的主要藥代動力學參數一致，無明顯差異。因此在小鼠藥代動力學實驗中隱靜脈微量采血法完全可以替代現有的常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法。

表3 小鼠單次給予靜脈注射及口服灌胃模型化合物A后微量和常規(guī)采血方法的主要藥代動力學參數Tab.3 Pharmacokinetics parameters of compound A in the CD-1 mice following an intravenous injection or gastric gavage

注：*表示不適用。下同。

Note.*indicates not applicable (NA). The same below.

注：a：小鼠單次給予靜脈注射1 mg/kg模型化合物；b：小鼠單次給予口服灌胃10 mg/kg模型化合物。下同。圖1 微量和常規(guī)采血法測得模型化合物A的平均藥時曲線Note. a: Mouse intravenous injection of 1 mg/kg of model compound each time. b: Mouse oral gavage of 10 mg/kg of model compound each time. The same below.Fig.1 Comparison of mean plasma concentration-time curves of model compound A in mice by regular blood sampling or micro-sampling method

采血方法Bloodcollectionmethods給藥途徑Adminis?trationroutes劑量(mg/kg)Dose藥時曲線下面積(μg/L?h)AUC(0?t)藥時曲線下面積(μg/L?h)AUC(0-∞)平均滯留時間(h)MRT(0-∞)消除半衰期(h)t1/2z達峰時間(h)Tmax分布容積(L/kg)Vz清除率[mL/(min?kg)]CLz峰濃度(μg/L)Cmax微量采血Micro?sampling常規(guī)采血Regularsampling靜脈注射IV1412414060800832940386245946507100083313591005微量采血Micro?sampling常規(guī)采血Regularsampling口服灌胃PO10246024652832025NA?NA?1247198021982431025NA?NA?1410

圖2 微量和常規(guī)采血法測得模型化合物B的平均藥時曲線Fig.2 Comparison of mean plasma concentration-time curves of model compound B in mice by regular blood sampling or micro-sampling method

采血方法Bloodcollectionmethods給藥途徑Adminis?trationroutes劑量(mg/kg)Dose藥時曲線下面積(μg/L?h)AUC(0?t)藥時曲線下面積(μg/L?h)AUC(0-∞)平均滯留時間(h)MRT(0-∞)消除半衰期(h)t1/2z達峰時間(h)Tmax分布容積(L/kg)Vz清除率[mL/(min?kg)]CLz峰濃度(μg/L)Cmax微量采血Micro?sampling常規(guī)采血Regularsampling靜脈注射IV116917706050083419412991421580707008365106259微量采血Micro?sampling常規(guī)采血Regularsampling口服灌胃PO10132147171205NA?NA?79496122412805NA?NA?432

圖3 微量和常規(guī)采血法測得模型化合物C的平均藥時曲線Fig.3 Comparison of mean plasma concentration-time curves of model compound C in mice by regular sampling or micro-sampling method

采血方法Bloodcollectionmethods給藥途徑Adminis?trationroutes劑量(mg/kg)Dose藥時曲線下面積(μg/L?h)AUC(0?t)藥時曲線下面積(μg/L?h)AUC(0-∞)平均滯留時間(h)MRT(0-∞)消除半衰期(h)t1/2z達峰時間(h)Tmax分布容積(L/kg)Vz清除率[mL/(min?kg)]CLz峰濃度(μg/L)Cmax微量Micro?sampling常規(guī)Regularsampling靜脈注射IV125625804090083526477462392410303008321692669微量Micro?sampling常規(guī)Regularsampling口服灌胃PO107828372117025NA?NA?7547437962117025NA?NA?741

圖4 微量和常規(guī)采血法測得模型化合物D的平均藥時曲線Fig.4 Comparison of mean plasma concentration-time curves of model compound D in the mice by regular sampling or micro-sampling method

3 討論

本研究在國內外首次建立了小鼠后肢隱靜脈微量采血法，并利用高靈敏度的質譜技術生物分析方法，成功實施了藥代動力學研究。微量采血法的應用得益于生物分析儀器靈敏度的大幅提高。通過表7可以發(fā)現，同樣濃度的血漿樣品在使用不同質譜進行定量時的靈敏度(色譜峰高)存在明顯差異。對于藥物研發(fā)早期的藥動學試驗，LLOQ(low limit of quantitation)值通常為1 ng/mL。雖然使用相對老舊型號的質譜也可滿足此要求，但往往需要使用更多的血漿以及其他生物樣品(20～50 μL)用于方法開發(fā)以及樣品測定，而新型儀器可以明顯降低動物血漿以及其他生物樣品的使用量(5～10 μL)。

表7 同一濃度血漿樣品(化合物B，1500 ng/mL)使用不同質譜儀分析時的靈敏度比較Tab.7 Sensitivity evaluation by different mass spectrometers using of the samples at the same concentration (compound B, 1500 ng/mL)

小鼠常用的采血方法有眼球摘除采血法、心臟采血法、眼眶后靜脈叢采血法、尾靜脈采血法等，這些方法各有其優(yōu)缺點。例如眼球摘除采血法采血量約為300～400 μL，而且易致小鼠失明、易感染，止血不嚴密時還可致小鼠死亡[7]；心臟采血法采血量可達800 μL，但由于小鼠個體小、心臟小、心臟搏動快、采血時位置較難固定，因而操作難度系數大，且需要麻醉[8-9]。這兩種方法均不可重復采血，不適用于目前的藥代動力學研究。眼眶后靜脈叢與尾靜脈采血法可重復采血，常用于藥代動力學研究，但采用眼眶后靜脈叢采血容易混入組織液，且需要麻醉，有可能造成眼球后組織損傷及鼻骨的破壞，甚至導致動物窒息死亡[10]。國外有報道采用尾靜脈微量采血法進行藥代動力學研究[6,11]，但尾靜脈采血法易凝血，常須采用暖燈或者溫水浴加熱尾部以確保重復采血操作正常進行。小鼠隱靜脈血管豐富，位置淺表[12]。因此本研究在國內外首次采用了小鼠后肢隱靜脈采血實施藥代動力學研究。該方法無需麻醉，操作方法簡單易學，采血位置和深度易把握，動物所承受痛苦降至最低。同時采血量減少了80%，動物使用量減少了65%。此外，因所有采血時間點來源于同一動物，實驗數據更加優(yōu)化。該采血方法更加符合動物福利3R原則，在藥代動力學及其他醫(yī)學實驗研究中應該予以推廣。

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