陳則東，沈曉鵬，穆洪云，張 泉

(1.江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300； 2.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225000)

溶瘤病毒因其殺死腫瘤細胞的能力而被廣泛用于腫瘤治療研究中，一些天然的溶瘤病毒(包括新城疫病毒、腮腺炎病毒、呼腸孤病毒和麻疹病毒)在試驗階段和臨床階段都表現(xiàn)出光明的前景[1-4]。目前使用的病毒選擇性地在腫瘤細胞內復制而導致細胞死亡。然而，因為它們仍然存在于正常的組織中，這種活病毒感染對于癌癥患者是一個安全威脅，除非它們的基因組不完整[5]。而且，宿主的抗病毒免疫可能會限制腫瘤細胞內的溶瘤病毒的復制，減弱病毒的殺傷能力。近來，因為能誘發(fā)多種抗腫瘤免疫反應而被廣泛認可[6-9]的滅活仙臺病毒(HVJ-E)粒子被發(fā)現(xiàn)能夠通過凋亡途徑直接殺死人的腫瘤細胞。滅活的HVJ-E先后被報道能夠誘導人的前列腺癌細胞系PC3、DU145[10-11]及小鼠黑色素瘤細胞(B16F10)的凋亡[12-13]。

肺癌是目前世界范圍內癌癥高死亡率的一個主要原因，盡管在過去數(shù)十年內各種治療方法(包括化療、放療和手術)長足發(fā)展，五年以上生存期的患者仍不足15%[14-15]。順鉑輔助化療極大地延長了肺癌患者的生存期，然而順鉑抵抗性成為限制其使用的主要障礙。文獻報道新城疫病毒能夠誘導順鉑抵抗性人肺癌細胞的凋亡，然而作為活病毒可能會對宿主產生潛在威脅，因此急需尋找一種新的治療策略。

本實驗擬將A549/DDP細胞與滅活的HVJ-E共培養(yǎng)，探討其是否能在體外誘導A549/DDP細胞凋亡；將滅活的HVJ-E病毒直接注射到腫瘤內，觀察其是否能在體內誘導腫瘤細胞凋亡和減緩腫瘤的生長，為進一步研究其誘導凋亡機制提供現(xiàn)象依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞、病毒與實驗動物

人非小細胞肺癌順鉑耐藥株A549/DDP購自中科院上海細胞庫，順鉑耐藥性A549/DDP細胞培養(yǎng)在含2 μg/mL順鉑(Sigma)的10% FBS 1640完全培養(yǎng)基以維持其抗性，在實驗之前3 d將其培養(yǎng)在不含順鉑的1640完全培養(yǎng)基中；仙臺病毒收自10～14日齡雞胚的絨毛膜尿囊液，純化、濃縮、紫外線輻照滅活(99 mJ/cm2)(參考之前文獻報道，滅活仙臺病毒不能正常復制，但仍保留融合能力[16])；BALB/c裸鼠由揚州大學比較醫(yī)學中心提供 [SCXK (蘇) 2017-0007]，5只/籠飼養(yǎng)在SPF環(huán)境 [SYXK (蘇) 2016-0020]，自由飲水與取食，實驗過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(SH30809.018)與胎牛血清(MZE145)購自賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司；順鉑(P4394)購自Sigma公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒(MK1020)與DAB(AR1000)顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程公司；FITC-annexin凋亡檢測試劑盒I(556547)購自BD Biosciences公司。Biosciences FACSAria流式細胞儀購自美國BD公司；獨立通風籠盒(IVC)購自蘇州馮氏實驗動物設備有限公司；倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司；RM2235徠卡輪轉切片機購自上海歐啟電子科技有限公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 流式細胞術分析細胞凋亡

細胞凋亡使用annexin V和PI雙染技術，通過流式細胞儀分析細胞膜表面磷脂酰絲氨酸重排的方法加以檢測。1×105A549/DDP細胞分別接受對照或者感染復數(shù)400 MOI的滅活HVJ-E處理，每組做三個重復，分別于12 h、24 h、36 h后檢測凋亡率；右下象限的細胞群(PI陰性，annexin V陽性)為早期凋亡細胞，右上象限的細胞群(PI陽性，annexin V陽性)為晚期凋亡細胞。

1.3.2 TUNEL實驗

將2×106A549/DDP細胞接種到BALB/c裸鼠皮下，當腫瘤直徑達到5 mm時，分別取100 μL HVJ-E溶液(內含2×1010病毒粒子)或100 μL PBS溶液對實驗組與對照組進行腫瘤內注射。注射3 d以后，處死小鼠，分離腫瘤，按照石蠟切片制作程序制作切片。石蠟切片分別被用于HE染色或者TUNEL實驗，操作方法如前所述[17]。TUNEL陽性細胞(棕染)被認為是凋亡細胞。

1.3.3 體內溶瘤實驗

注：A：A549細胞凋亡隨時間變化的流式細胞術測定結果；B：A549細胞凋亡隨時間變化的統(tǒng)計分析圖。感染復數(shù)為400 MOI。與24 h相比，**P < 0.01.圖1 滅活仙臺病毒體外誘導A549/DDP細胞凋亡Note. A: Apoptosis in A549 cells over time detected by flow cytometry. B: Statistics of apoptosis of A549 cells over time. MOI=400∶1. Compared with 24 h,**P < 0.01.Fig.1 Inactivated Sendai virus induces apoptosis of A549/DDP cells in vitro

取20只6周齡BALB/c裸鼠隨機分成兩組，每組10只(雌雄各半)，分別指定為實驗組和對照組。實驗組每只小鼠于背部分別接種A549/DDP細胞(2×106)與HVJ-E(2×1010病毒粒子)混合液；對照組則只接種A549/DDP細胞(2×106)。每日觀察腫瘤生長情況，利用游標卡尺測量腫瘤的長和寬，并按下述公式計算腫瘤體積：腫瘤體積=長×寬2/2[12]。同時將2×106A549/DDP接種到BALB/c裸鼠皮下，當腫瘤直徑達到5 mm時，分別取100 μL HVJ-E溶液(內含2×1010病毒粒子)或100 μL PBS溶液對實驗組與對照組進行腫瘤內注射，連續(xù)注射三次，每次間隔2 d，首次注射后每隔5 d測量一次腫瘤體積，并繪制腫瘤生長曲線。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 滅活的HVJ-E在體外能夠誘導A549/DDP細胞凋亡

為了判斷滅活的仙臺病毒能否在體外誘導A549/DDP細胞凋亡，1×105A549/DDP細胞分別接受對照(PBS)或者感染復數(shù)400 MOI的滅活HVJ-E處理，于12 h、24 h、36 h后收集細胞，annexin V/PI雙染法分析不同感染時間下的細胞凋亡率。如圖1A、1B所示，隨著感染時間的遞增，A549/DDP的凋亡率逐漸增加，且12 h與24 h、24 h與36 h的晚期凋亡率相比差異均有顯著性(P< 0.01)。

2.2 滅活的HVJ-E對A549/DDP小鼠肺癌模型表現(xiàn)出良好的溶瘤作用

為了評價滅活的HVJ-E在A549/DDP小鼠肺癌模型中的溶瘤能力，BALB/c裸鼠皮下接種A549/DDP細胞，然后采用瘤內注射的方式對荷瘤小鼠接種一次滅活的HVJ-E或者PBS。3 d之后處死小鼠，通過HE染色和TUNEL實驗檢查腫瘤切片。HE染色顯示滅活的HVJ-E處理組小鼠的腫瘤切片呈現(xiàn)出特征性的凋亡細胞，如染色體深染、凝集，甚至表現(xiàn)出鐮刀狀染色質固縮(圖2A)。除此之外，TUNEL實驗結果也顯示出較多的棕染細胞(圖2C)。相反，在PBS對照組中則很少出現(xiàn)自溶或者凋亡的細胞(圖2B、2D)。

注：A：A549/DDP + HVJ-E組(HE染色)；B：A549/DDP + PBS組(HE染色)；C：A549/DDP + HVJ-E組(TUNEL染色)；D：A549/DDP + PBS組(TUNEL染色)。圖2 滅活仙臺病毒體內溶瘤效果(× 400)Note. A: A549/DDP + HVJ-E group, HE staining. B: A549/DDP + PBS group, HE staining. C: A549/DDP + HVJ-E group, TUNEL staining. D: A549/DDP + PBS group, TUNEL staining.Fig.2 Oncolytic effect of inactivated Sendai virus in vivo

2.3 滅活的HVJ-E對A549/DDP小鼠肺癌模型腫瘤體積-時間變化曲線的作用

將2×106A549/DDP細胞與400 MOI的滅活HVJ-E共培養(yǎng)，24 h后接種到裸鼠皮下，并測量腫瘤體積變化情況。如圖3A所示，隨著接種時間的延續(xù)，對照組腫瘤體積不斷增大，在第16天時體積達到400 mm3，而實驗組腫瘤體積出現(xiàn)增大-減小-消失的變化，由此也可說明滅活的仙臺病毒能夠誘導A549/DDP細胞的凋亡。

將2×106A549/DDP細胞接種到BALB/c裸鼠皮下，當腫瘤直徑達到5 mm時，分別取100 μL HVJ-E溶液(內含2×1010病毒粒子)或100 μL PBS溶液對荷瘤鼠進行腫瘤內注射，連續(xù)注射三次，每次間隔2 d。使用游標卡尺測定腫瘤的長與寬，并通過公式：腫瘤體積(mm3)=長×寬2/2計算腫瘤體積。如圖3B所示，與PBS對照組相比，滅活的HVJ-E具有抑制順鉑耐藥性的肺腺癌細胞生長的作用，差異有顯著性(P< 0.05)。

注：A：A549/DDP細胞與滅活HVJ-E共培養(yǎng)24 h后接種裸鼠的腫瘤體積-時間變化曲線；B：瘤內注射HVJ-E后腫瘤體積-時間變化曲線。圖3 肺腺癌腫瘤體積-時間變化曲線Note. A: Tumor volume-time curves of A549/DDP cells co-cultured with inactivated HVJ-E for 24 h and then inoculated into nude mice. B: Tumor volume-time curves after intratumoral injection with HVJ-E.Fig.3 Tumor volume-time curves of lung adenocarcinoma

3 討論

細胞凋亡是細胞活動過程中的一種重要改變，細胞凋亡的失調可破壞細胞增殖與細胞死亡之間的平衡進而誘發(fā)多種人類疾病，包括神經退行性疾病、自身免疫性疾病和許多類型的癌癥等[18]。因此，細胞凋亡被廣泛認為具有巨大的治療癌癥的潛能。靶向細胞凋亡也逐漸成為癌癥藥物發(fā)現(xiàn)的研究熱點，通過抗腫瘤藥物來誘導凋亡以抑制腫瘤細胞的增殖[19]。而固有的或獲得性的耐藥性嚴重阻礙了癌癥的治療。因此，解決耐藥性造成的困擾受到越來越多的關注。

有研究發(fā)現(xiàn)，β-欖香烯作為天然化合物就具有廣譜抗腫瘤效應，它在A549/DDP細胞中通過下調P-gp蛋白(P-gp蛋白能使抗腫瘤藥物從細胞內外排，從而減少細胞內藥物的累積)發(fā)揮強烈的逆轉作用，從而提高腫瘤細胞對抗癌藥物的化療敏感性[20]。近年來，隨著溶瘤病毒研究的不斷深入，利用病毒治療癌癥已經取得巨大進步。在新城疫病毒(NDV)誘導的A549/DDP細胞凋亡的研究中，發(fā)現(xiàn)NDV主要通過caspase途徑尤其是caspase-9途徑來誘導細胞凋亡，且MAPK和AKT途徑對A549/DDP的凋亡也具有一定的作用[17, 21]。然而利用活病毒治療癌癥顯然對病人有一定的安全風險。

越來越多的研究表明，滅活的仙臺病毒(HVJ-E)具有殺傷腫瘤細胞的潛能。HVJ-E首次被報道以劑量依賴方式在人的前列腺癌細胞株PC3和DU145中直接誘導凋亡[12-13]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，HVJ-E來源的大約300 bp的RNA片段與腫瘤細胞的選擇性凋亡有關。人的RIG-I能夠識別HVJ-E來源的300 bp左右的RNA片段并與IFN-β啟動子相互作用，啟動信號級聯(lián)，促使I型IFN產生[22]。這種I型IFN通過JAK-STAT途徑誘導腫瘤細胞選擇性凋亡[23]。通過使用JAK-STAT抑制劑并不能完全阻止HVJ-E誘導PC3細胞的凋亡，提示I型IFN介導的JAK-STAT途徑并非是HVJ-E誘導凋亡的唯一途徑[12]。在小鼠黑色素瘤B16F10細胞中，HVJ-E還通過MAPK途徑誘導B16F10細胞凋亡。有報道指出，HVJ-E能夠通過誘導免疫反應尤其是T細胞介導的細胞毒作用選擇性殺死腫瘤細胞[24]，然而BALB/c裸鼠缺乏T細胞從而排除了HVJ-E誘導T細胞介導免疫反應。本實驗中，BALB/c裸鼠皮下接種A549/DDP細胞，然后采用瘤內注射的方式對荷瘤小鼠接種HVJ-E，HVJ-E表現(xiàn)出了良好的溶瘤作用。因此，HVJ-E所誘導的凋亡效應存在錯綜復雜的機制。

HVJ-E不僅可以作為載體遞送抗腫瘤藥物，激活抗腫瘤免疫，同時還能直接殺傷腫瘤細胞和誘導腫瘤細胞凋亡。研究清楚HVJ-E作用腫瘤細胞的機制將加深我們對HVJ-E抗腫瘤效應的認識。本次實驗通過流式細胞術和組織切片TUNEL法分別證明了HVJ-E具有在體外和體內誘導順鉑耐藥性A549/DDP細胞凋亡的作用，通過誘導凋亡減緩腫瘤生長，為進一步研究HVJ-E誘導順鉑耐藥性A549/DDP的凋亡機制提供現(xiàn)象依據(jù)。

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