彭 源，趙延禮,2，蘇曉靈，沈國(guó)平，龍啟福,2，秦海蘭，王 嶸,2*

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 青海 西寧 810000；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810000； 3.青海省人民醫(yī)院， 青海 西寧 810000)

心肌細(xì)胞的損傷和凋亡是臨床心血管疾病中常見(jiàn)的基礎(chǔ)病理變化。心臟功能性毒蕈堿受體亞型3(M3muscarinic acetylcholine receptor, M3-mAChR)的發(fā)現(xiàn)及其功能的研究是近年來(lái)心血管生理學(xué)和病理生理學(xué)的一大進(jìn)展[1]，大量的研究表明M3受體在調(diào)節(jié)和維持心臟功能中具有重要作用[2]，可減慢心率(heart rate, HR)，縮短動(dòng)作電位時(shí)程，減弱心肌收縮力(action potential duration, APD)[3]。發(fā)揮逆轉(zhuǎn)病理性心肌肥大，保護(hù)缺血的心肌細(xì)胞，抗心律失常、抗心力衰竭等作用[4]。然而，目前關(guān)于M3受體在心肌急性低氧引起的損傷和凋亡中的研究還鮮有報(bào)道。

因此，本研究旨在探索激活M3受體對(duì)氯化鈷(cobaltous chloride hexahydrate, CoCl2)引起的心肌細(xì)胞低氧損傷的作用及機(jī)制，為該領(lǐng)域的研究發(fā)展提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(上海中科院細(xì)胞庫(kù))；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液(Hyclone公司)；卡巴膽堿(carbachol, CCH)和4-二苯乙酰氧基-N-甲基-哌啶甲碘化物(4-diphenyl-acetoxy-N-methyl-piperidine methiodide, 4-DAMP)(Sigma公司)；MTT和DMSO(Solarbio公司)；β-actin、caspase- 3、M3受體、HIF- 1α和HO- 1(Abcam公司)；二抗(中杉金橋生物技術(shù)公司)；蛋白marker(Pageruler公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組：10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞系H9c2。

對(duì)照組；低氧模型組(給予600 μmol/L CoCl2分別培養(yǎng)3、6、12和24 h)；CCH干預(yù)組(提前10 min給予100 μmol/L CCH處理)，其余處理同低氧模型組；4-DAMP阻斷組(提前10 min用100 nmol/L 4-DAMP和100 μmol/L CCH處理)，其余處理同低氧模型組。

1.2.2 MTT法測(cè)細(xì)胞活力：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔板每孔加入100 μL，鋪板使待測(cè)細(xì)胞密度達(dá)到6 000個(gè)/孔。邊緣36個(gè)孔用無(wú)菌PBS填充。5% CO2、37 ℃孵育過(guò)夜，待每孔細(xì)胞匯合度達(dá)到60%時(shí)，依據(jù)各分組條件，將藥物作用時(shí)間終點(diǎn)設(shè)為一致，加入藥物，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待藥物作用結(jié)束，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)。繼續(xù)培養(yǎng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO并置于培養(yǎng)箱中10 min，使結(jié)晶充分溶解。最后置于酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值。細(xì)胞活力=(藥物組A值-調(diào)零孔A值)/(對(duì)照孔A值-調(diào)零孔A值)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞藥物處理, 0.25%胰蛋白酶-EDTA液消化，預(yù)冷的PBS沖液洗3次，緩沖液重懸細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過(guò)篩，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。檢測(cè)前30 min加入FITC-annexinⅤ，低溫避光孵育，檢測(cè)前5 min加入碘化丙啶。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。以Flowjo分析結(jié)果。

1.2.4 Western blot檢測(cè)M3受體、caspase- 3、HIF- 1α和HO- 1蛋白表達(dá)水平：將H9c2心肌細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至匯合度80%時(shí)，根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素，然后用預(yù)冷的PBS洗2次，加入裂解液，4 ℃靜置30 min，12 000 r/min(r=13.5 cm)離心10 min，取上清，進(jìn)行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉60 min，加入稀釋后的一抗體4 ℃過(guò)夜。取出PVDF膜，PBST洗3次，結(jié)合每次10 min。放入二抗，室溫?fù)u床孵育2 h。再次取出PVDF膜并用PBST洗3遍。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，將圖片以Tif格式保存并分析結(jié)果。按照以上步驟檢測(cè)M3受體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶- 3(caspase- 3)、低氧誘導(dǎo)因子- 1(hypoxia inducible factor- 1, HIF- 1)和血紅素加氧酶1(heme oxygenase- 1, HO- 1)的蛋白表達(dá)水平。利用Image-J圖像分析軟件檢測(cè)蛋白吸光度值與β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCH對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

用CoCl2處理12 h后，細(xì)胞存活率呈劑量依賴顯著降低(P<0.01) (圖1A)；600 μmol/L CoCl2處理12 h后細(xì)胞存活下降到50%左右，選擇600 μmol/L CoCl2作為低氧損傷濃度。100～200 μmol/L CCH處理12 h產(chǎn)生抗細(xì)胞毒性作用(圖1B)，細(xì)胞活力出現(xiàn)回升(P<0.01)，選擇100 μmol/L作為CCH的干預(yù)濃度。

細(xì)胞活力隨低氧處理時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)行性降低(圖1C)，且相對(duì)于低氧模型組，CCH干預(yù)組活性更高(P<0.01)。相比對(duì)照組，低氧模型組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01) (圖1D)；相對(duì)于低氧模型組，CCH干預(yù)組細(xì)胞活力明顯增加(P<0.01)，且被4-DAMP抑制。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

對(duì)照組中僅有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡； CoCl2處理的低氧模型組中可見(jiàn)較多凋亡細(xì)胞 (P<0.01)；CCH干預(yù)組可見(jiàn)散在凋亡細(xì)胞，凋亡數(shù)明顯減少 (P<0.01)； 4-DAMP阻斷組仍可見(jiàn)到較多凋亡細(xì)胞 (P<0.01)(圖2)。

A.toxicity of CoCl2to cardiac myocytes; B.anti hypoxia effect of CCH; C.comparison of cell viability between hypoxia group and CCH group at different time points; D.4-DAMP inhibits the protective effect of CCH on cardiac myocytes;*P<0.01 compared with control group;**P<0.01 compared with hypoxia group;***P<0.01 compared with CCH group

圖1CoCl2對(duì)心肌細(xì)胞的毒性以及CCH發(fā)揮的抗低氧作用

2.3 M3受體、HIF- 1α、HO- 1、caspase- 3蛋白表達(dá)水平

對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞可表達(dá)一定量的M3受體及少量caspase- 3， HIF- 1α和HO- 1幾乎不表達(dá)；低氧模型組中，HIF- 1α、HO- 1和caspase- 3蛋白表達(dá)水平明顯上升(P<0.01)。CCH干預(yù)組中caspase- 3表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；且HIF- 1α和HO- 1表達(dá)明顯增加(P<0.01)。4-DAMP阻斷組中，CCH介導(dǎo)的HIF- 1α、HO- 1蛋白表達(dá)上調(diào)作用被抑制(P<0.05)(圖3)。

3 討論

與之前的報(bào)道一致[5]，應(yīng)用600 μmol/L CoCl2處理12 h可對(duì)H9c2大鼠心肌細(xì)胞造成明顯的低氧損傷。表現(xiàn)出細(xì)胞增殖活力降低，細(xì)胞凋亡率以及凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)caspase- 3表達(dá)水平增加。經(jīng)100 μmol/L CCH預(yù)處理之后，MTT實(shí)驗(yàn)中觀察到心肌細(xì)胞的活力比之前明顯增高，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示凋亡較CoCl2低氧模型組明顯減少。且上述作用會(huì)被低濃度的4-DAMP抑制。推測(cè)出激活M3受體在低氧條件下發(fā)揮了抗心肌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

HIF- 1α是一種普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中且低氧條件下穩(wěn)定表達(dá)的蛋白因子。HIF- 1α通過(guò)反式作用與一些特定基因的順式作用元件相互結(jié)合，并調(diào)控相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平[6]。這些被HIF- 1α調(diào)控的基因編碼一些關(guān)鍵的蛋白質(zhì)，其中包括HO- 1。HO- 1作為血紅素加氧酶的誘導(dǎo)型，主要在氧化應(yīng)激、低氧、細(xì)胞凋亡和內(nèi)毒素等作用的誘導(dǎo)下表達(dá)增加[7]，可發(fā)揮抗感染、抗氧化、抗凋亡等功能[8]。

實(shí)驗(yàn)中觀察到在激活M3受體的H9c2大鼠心肌細(xì)胞中HIF- 1α及其下游蛋白HO- 1表達(dá)水平出現(xiàn)上調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白caspase- 3表達(dá)量減少；細(xì)胞活力明顯上升，凋亡明顯減少。且應(yīng)用M3受體特異性阻斷劑4-DAMP干擾后， CCH介導(dǎo)的相關(guān)作用被抑制。提示M3受體激活參與了低氧環(huán)境下大鼠心肌細(xì)胞系H9c2的保護(hù)作用，且這種作用可能是通過(guò)調(diào)控HIF- 1α及其下游HO- 1蛋白的表達(dá)水平來(lái)介導(dǎo)完成。

*P<0.01 compared with control group;**P<0.01 compared with hypoxia group;***P<0.01 compared with CCH group

A.expression of M3-mAChR in Western blot assay;*P<0.05 compared with hypoxia groups,**P<0.01 compared with CCH group; B, C.expression levels of caspase- 3 and HIF- 1α in Western blot assay;*P<0.01 compared with control group,**P<0.01 compared with hypoxia group,△P<0.01 compared with CCH group; D.Western blot indicated expression level of HO- 1;*P<0.05 compared with control group,△P<0.05 compared with hypoxia group,#P<0.05 compared with CCH group

迄今為止，學(xué)術(shù)界對(duì)該受體進(jìn)行了大量的研究。發(fā)現(xiàn)激活M3受體可上調(diào)環(huán)氧化酶- 2(cyclooxygenase- 2，COX- 2)的表達(dá)和維持縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)的磷酸化水平，促進(jìn)細(xì)胞間電偶聯(lián)[9]，減少心肌缺血再灌注損傷后的心肌梗死面積，對(duì)抗惡性心律失常[10]；調(diào)控凋亡信號(hào)分子p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，減少細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載[11]；上調(diào)SOD表達(dá)，減少M(fèi)DA含量來(lái)降低氧化應(yīng)激水平[12]。這些結(jié)果都表明M3受體在心肌細(xì)胞中的保護(hù)作用是通過(guò)介導(dǎo)多種信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而，對(duì)于參與了M3受體介導(dǎo)的信號(hào)通路中其他的蛋白因子是否也發(fā)揮了作用目前尚不明確；且各種機(jī)制之間是否存在關(guān)聯(lián)也需要進(jìn)一步研究。此外，體外細(xì)胞模擬實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)也存在一定的差異，尚需進(jìn)一步論證。

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新聞點(diǎn)擊

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎增加心臟病風(fēng)險(xiǎn)

據(jù)美國(guó)WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 12- 01)報(bào)道，最新研究指出，有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可能會(huì)增加心臟病發(fā)作、腦卒中以及其他心臟疾病相關(guān)問(wèn)題的風(fēng)險(xiǎn)。

研究結(jié)果顯示，這些患者罹患心臟病相關(guān)問(wèn)題的比例是一般人的一倍以上，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者有心臟問(wèn)題的比例和2型糖尿病患者類似。

但這篇研究并未證明因果關(guān)系，只是顯示類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與心臟病有關(guān)。

關(guān)節(jié)疼痛、僵硬以及腫脹是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的主要特征，但這個(gè)疾病也會(huì)造成體內(nèi)器官的炎性反應(yīng)。研究結(jié)果指出，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的全身性慢性反應(yīng)是心臟病發(fā)作的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。

專家認(rèn)為，有效地治療系統(tǒng)性炎性反應(yīng)，可以降低這些患者的心臟疾病風(fēng)險(xiǎn)。