劉俊雅，范姝婕，黃 薇，楊 楠，劉雁勇

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 藥理學(xué)系， 北京 100005)

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，約90%的胰腺癌為起源于腺管上皮的導(dǎo)管腺癌。胰腺癌是預(yù)后最差的惡性腫瘤，該病患者的5年生存率不足5%[1- 2]。盡管在過(guò)去的20年間人們付出很大努力，其發(fā)病率和病死率近年來(lái)仍明顯上升。預(yù)計(jì)到2030年，胰腺癌將成為全球第2位癌相關(guān)的死因[3]。胰腺癌臨床治療20年來(lái)未有大的進(jìn)展，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制有待深入研究。熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)是生物界中廣泛存在的一類具有高度保守性的蛋白質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞受到不利因素(如缺血、缺氧等)刺激時(shí)，它能迅速大量合成，并與客戶蛋白結(jié)合以調(diào)節(jié)其結(jié)構(gòu)及功能。作為熱休克蛋白家族的重要一員，Hsp90除了參與蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程，其客戶蛋白還包括一系列在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的腫瘤相關(guān)蛋白[4]，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑。本研究應(yīng)用組織芯片的免疫組化方法，分析Hsp90在胰腺癌腫瘤組織及癌旁組織中表達(dá)情況，為Hsp90作為胰腺癌潛在的治療靶標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例：共包括63例胰腺癌患者組織標(biāo)本(胰腺癌組織芯片)，本實(shí)驗(yàn)獲得有效染色樣本共62例(編號(hào)為D20A0273的標(biāo)本缺失，本實(shí)驗(yàn)未予分析)。其中男36例，女26例，年齡范圍在41～85 歲，平均年齡為66歲。參照AJCC第7版制定的標(biāo)準(zhǔn)，去除無(wú)臨床分期病例，1期5例，2期45例，4期4例；組織病理分級(jí)Ⅰ-Ⅱ 10例，Ⅱ 26例，Ⅱ-Ⅲ 26例；去除無(wú)TNM分期病例，T1-T2分期9例，T3分期37例；去除無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)病例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)小于3的16例，轉(zhuǎn)移數(shù)大于11的13例。所有病例均無(wú)同時(shí)患其他惡性腫瘤，患者手術(shù)前均未經(jīng)放、化療。

1.1.2 主要試劑與材料：胰腺癌組織芯片(上海芯超生物科技有限公司)；兔抗人Hsp90單克隆抗體(Cell Signaling公司)；通用型免疫組化二步法檢測(cè)試劑盒、乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液和DAB辣根過(guò)氧化物酶顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；其他試劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

免疫組化檢測(cè)Hsp90表達(dá)：胰腺癌組織芯片脫蠟，PBS緩沖液沖洗3遍，EDTA抗原修復(fù)液在95 ℃進(jìn)行抗原修復(fù)15 min、參照通用型免疫組化二步法檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明操作。高倍顯微鏡下觀察Hsp90在各例標(biāo)本的腫瘤與癌旁組織中表達(dá)情況。Hsp90染色陽(yáng)性判斷為鏡下組織結(jié)構(gòu)完整、清晰、定位明確、胞質(zhì)和(或)胞核為棕黃色，染色明顯高于背景者。40倍物鏡下，在胰腺癌組織芯片上的每個(gè)組織點(diǎn)任選3個(gè)視野，拍攝照片，用 IPP 6.0軟件通過(guò)宏處理進(jìn)行吸光度值分析。測(cè)定每個(gè)組織點(diǎn)的選擇區(qū)域(area)的面積及該特定區(qū)域的累積吸光度值(IA)，并將這3個(gè)視野的累積吸光度值之和除以區(qū)域之和，然后計(jì)算得出一個(gè)代表每個(gè)芯片組織點(diǎn)的平均吸光度值(mean optical density=IASUM/area SUM)，以作為該組織點(diǎn)的測(cè)量值。該吸光度值的高低與蛋白表達(dá)量多少呈正比。實(shí)驗(yàn)操作和拍照統(tǒng)計(jì)過(guò)程的每一步都嚴(yán)格統(tǒng)一控制，以保證各個(gè)組織點(diǎn)的操作處理?xiàng)l件相同。最后，統(tǒng)一對(duì)其平均吸光度值的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以分析各個(gè)指標(biāo)之間的相互關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用ANOVA或者t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織芯片免疫組化染色結(jié)果

免疫組化染色后的胰腺癌組織芯片陣列排列(圖1A)，3例代表性胰腺癌病理標(biāo)本免疫組化圖(圖1B)和Hsp90表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系(圖1C)。

2.2 Hsp90在胰腺癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)比較了Hsp90在相應(yīng)的癌與癌旁組織中的表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)、年齡和性別的關(guān)系(表1)。Hsp90在Ⅱ-Ⅲ級(jí)胰腺癌組織中表達(dá)量明顯高于Ⅰ-Ⅱ級(jí)(P<0.05)；胰腺癌臨床晚期的組織中Hsp90表達(dá)水平更高，臨床2期胰腺癌組織中的表達(dá)量明顯高于1期(P<0.05)；T3分期癌組織的Hsp90表達(dá)量也高于T1-T2分期(P<0.05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)多的胰腺癌組織具有相對(duì)較高的Hsp90表達(dá)水平(P<0.05)。

A.a-h.1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, i1, i3 and i5-i8 are pancreatic cancer tissues; a-h.2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, i2 and i4 are para-carcinoma tissues; B.expressions of Hsp90 in 3 cases of typical pathological specimens; presented in the coHesponding position of figure A;C.a, b.relative expression of Hsp90 in different histologic grades of the pancreatic cancer and para-carcinoma;*P<0.05 compared with Ⅰ-Ⅱ; c, d.relative expression of Hsp90 in different AJCC phases of the pancreatic cancer and para-carcinoma; 1,2,4 represents the AJCC phase 1, phase2, phase3, respectively;*P<0.05 compared with phase 1; e, f.relative expression of Hsp90 in different T phases of the pancreatic cancer and para-carcinoma;*P<0.05 compared with phase T1-T2; g, h.relative expression of Hsp90 in different numbers of lymph nodes;*P<0.05 compared with lymph node metastasis number less than 3; i, j.relative expression of Hsp90 in different ages of the pancreatic cancer and para-carcinoma; k, l.relative expression of Hsp90 in different genders of the pancreatic cancer and para-carcinoma

圖1 胰腺癌組織芯片陣列排列示意圖、3例代表性病理標(biāo)本的免疫組化圖和胰腺癌組織的Hsp90表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

*P<0.05 compared with para-carcinoma.

2.3 Hsp90在胰腺癌組織中的表達(dá)水平與患者生存期的關(guān)系

胰腺癌組織中Hsp90表達(dá)量高的患者生存期略短(圖2A)，平均13.8個(gè)月，而胰腺癌組織中Hsp90表達(dá)量低的患者生存期則為21.5個(gè)月。胰腺癌旁組織中Hsp90表達(dá)量與患者生存期的關(guān)系見圖2B。

A.relationship between relative expression of Hsp90 and the patient survival curve in pancreatic cancer tissues; B.relationship between relative expression of Hsp90 and the patient survival curve in para-carcinoma tissues圖2 胰腺癌組織的Hsp90表達(dá)量與患者生存期的關(guān)系Fig 2 Relationship between expression of Hsp90 and the patient survival in pancreatic cancer tissues

3 討論

熱休克蛋白是廣泛存在于生物界中具有高度保守性質(zhì)的多肽類蛋白質(zhì)，作為伴侶蛋白，它參與靶蛋白的合成、積聚、折疊、裝配、運(yùn)輸和降解等過(guò)程[5]。Hsps是一個(gè)大的蛋白質(zhì)超家族，根據(jù)分子質(zhì)量的大小可將該家族分為6類：大分子熱休克蛋白(100～110 ku)、Hsp90(83～93 ku)、Hsp70(66～78 ku)、Hsp60(60 ku)、Hsp40(40 ku)以及小分子熱休克蛋白(15～30 ku)[6]。作為細(xì)胞內(nèi)最重要的分子伴侶之一，Hsp90在許多腫瘤中的表達(dá)水平升高，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4]。它在多種腫瘤中的客戶端癌基因蛋白的激活、穩(wěn)定、折疊、聚合、水解和轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程中扮演重要角色[7]。總的來(lái)說(shuō)，抑制Hsp90可以通過(guò)影響多條信號(hào)通路而發(fā)揮抗腫瘤作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的Hsp90與黑色素瘤、肝癌等預(yù)后不良密切相關(guān)[8- 9]，表明Hsp90可能作為一種重要的信號(hào)元件參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。

本研究發(fā)現(xiàn)63例胰腺癌標(biāo)本中Hsp90在胰腺癌組織中高表達(dá)，而癌旁中的Hsp90表達(dá)量低于癌組織。Hsp90在胰腺癌中的過(guò)度表達(dá)可能是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞無(wú)限增殖過(guò)程需要大量的Hsp90維持穩(wěn)定，并且腫瘤造成的應(yīng)激環(huán)境也會(huì)誘導(dǎo)Hsp90的過(guò)度表達(dá)。作為一個(gè)全新的腫瘤廣譜標(biāo)志物，Hsp90可用來(lái)協(xié)助探討相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理及患者的治療、預(yù)后等，如檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤患者血清中Hsp90的表達(dá)情況[10]。自格爾德霉素在 1992年作為第一個(gè)Hsp90抑制劑被發(fā)現(xiàn)以來(lái)[11]，越來(lái)越多的其他相關(guān)的抑制劑被開發(fā)并陸續(xù)進(jìn)入到臨床研究階段，如 Hsp90抑制劑阿螺旋霉素用于晚期實(shí)體腫瘤患者的臨床Ⅰ期試驗(yàn)并取得了初步成果[12]，這間接證實(shí)了Hsp90在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Hsp90的表達(dá)與病理分級(jí)、臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)密切相關(guān)，這提示Hsp90作為伴侶蛋白，與胰腺癌的高侵襲、高轉(zhuǎn)移能力具有一定的相關(guān)性?？傊?，本研究通過(guò)免疫組化法初步分析了 Hsp90在63例胰腺癌患者標(biāo)本中的表達(dá)情況，這為以后尋找胰腺癌早期診斷、治療及臨床預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物提供了有價(jià)值的參考資料。Hsp90對(duì)胰腺癌患者的臨床意義有待更深入的研究證實(shí)。

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