金 濤，李 倩，歐 潔，王艷林，吳紅艷, *

(1.三峽大學(xué)人民醫(yī)院(宜昌市第一人民醫(yī)院)； 2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 3.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)系， 湖北 宜昌 443002)

鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成的關(guān)鍵酶[1- 2]。細(xì)胞內(nèi)ODC活性增加與細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤形成密切相關(guān)[3]。

哺乳動(dòng)物ODC的調(diào)控非常復(fù)雜[3]。細(xì)胞內(nèi)存

在一種天然的ODC 非競(jìng)爭(zhēng)性蛋白抑制因子，即抗酶(antizyme，AZ)。AZ與ODC單體的結(jié)合可促進(jìn)ODC亞基以非泛素化形式被26S 蛋白酶體降解，降低ODC活性[4- 5]。

抗酶抑制劑(antizyme inhibitor，AZIN)也參與對(duì)ODC的調(diào)控[6- 7]，它可通過(guò)封閉AZ來(lái)穩(wěn)定ODC水平。AZIN 能與AZ 高親和性結(jié)合為雜二聚體，且AZIN-AZ 的親和力遠(yuǎn)大于AZ-ODC 的親和力。所以AZIN 能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合AZ-ODC 復(fù)合體中的AZ，釋放被AZ 捕獲的ODC 亞基，恢復(fù)ODC 的酶活性。

AZIN在乳腺癌、肝癌及皮膚癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)[6]，本研究在確認(rèn)前列腺癌細(xì)胞高表達(dá)AZIN的基礎(chǔ)上，擬通過(guò)siRNA(small interfering RNA)干擾AZIN的表達(dá)水平，探討其對(duì)ODC表達(dá)水平及對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響，為抗腫瘤治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、組織及試劑

PC3細(xì)胞(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)；正常前列腺組織和前列腺癌組織分別來(lái)自前列腺癌根治術(shù)患者及意外死亡者；AZIN(Proteintech公司)； siRNA-AZIN序列：oligo- 877:5′-GGAACCGGAUUU GCUUGUUTT-3′(正義)，5′-AACAAGCAAAUCCGG UUCCTT-3′(反義)；oligo-1006：5′-GGAGUGAAU AUCCUGACAUTT-3′(正義)，5′-AUGUCAGGAUA UUCACUCCTT-3′(反義)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；Trizol和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)人前列腺癌PC3細(xì)胞系。

1.2.2 Western blot檢測(cè)AZIN的表達(dá): 分別提取各組織及前列腺癌PC3細(xì)胞的總蛋白，用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h，4 ℃一抗孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL顯色發(fā)光檢測(cè)相應(yīng)條帶。β-actin作為內(nèi)參照。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組: 當(dāng)人前列腺癌PC3細(xì)胞系增殖至80%時(shí)，用lipofectamine2000試劑嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分組：未轉(zhuǎn)染的PC3細(xì)胞、AZIN-siRNA- 877轉(zhuǎn)染組、AZIN-siRNA- 1006轉(zhuǎn)染組和 Scrambled siRNA轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行RNA干擾效率的檢測(cè)。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞AZ、AZIN和ODC mRNA表達(dá)水平: 用Trizol試劑裂解細(xì)胞，提取總RNA，通過(guò)cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別擴(kuò)增AZ、AZIN、ODC及β-actin。AZ的上游引物為5′-C CTCCACTGCTGTAGTAACCCG-3′，下游引物為5′-C CAAAAAGCTGAAGGTTCGGA-3′；AZIN的上游引物為5′-ATGTGTGTTTGACATGGCTGGAG-3′,下游引物為5′-GAGGCTCATCTTCCTTGTATTTCTTG-3′；ODC的上游引物為5′-AAAGCAAAGTTGGTTTTGCGG ′, 下游引物為5′-CCTTGGCATCTGAGCGAGTA-3′。β-actin的上游引物為5′-GGCATCACACTTTCTACA ACG-3′, 下游引物為5′-GGCAGGAACATTAAAGG TTTC-3′。PCR反應(yīng)條件為在94 ℃預(yù)變性5 min后開(kāi)始循環(huán)，然后94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)后，再于72 ℃延伸5 min結(jié)束擴(kuò)增。所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞AZ、AZIN和ODC 蛋白表達(dá)水平: 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)蛋白濃度，去等量蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h，4 ℃一抗孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，用相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL顯色發(fā)光檢測(cè)相應(yīng)條帶。β-actin作為內(nèi)參照。

面對(duì)腦卒中這個(gè)人類共同的敵人，華山醫(yī)院作為領(lǐng)頭羊，將繼續(xù)堅(jiān)持“全程化、精細(xì)化、高效化、績(jī)效化和讓社會(huì)公眾放心滿意”的目標(biāo)，不斷深化與完善上海市腦卒中預(yù)防與救治服務(wù)體系建設(shè)，為保障市民健康貢獻(xiàn)自己的力量。

1.2.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖: 將處于對(duì)數(shù)增殖期的PC3細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于96孔板，轉(zhuǎn)染siRNA，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染4 h后換成完全培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，棄上清液，加MTT溶液，使其終濃度為200 mg/L，37 ℃孵育4 h后加DMSO 150 μL，振蕩混勻后測(cè)量570 nm處的吸光度值,分別得到24、48和72 h數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS(version 10.0)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用均數(shù)比較的t檢驗(yàn)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比較各組資料差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織及前列腺癌細(xì)胞AZIN表達(dá)量增加

與正常前列腺組織相比，前列腺癌組織及前列腺癌PC3細(xì)胞AZIN的蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)(圖1)。

2.2 siRNA-AZIN在mRNA水平下調(diào)AZIN表達(dá)

相對(duì)于空白組(no siRNA)和陰性對(duì)照組(scramble siRNA)，oligo- 877(siRNA1)和 oligo- 1006(siRNA2)均可降低AZIN RNA表達(dá)水平(P<0.01)(圖2)。

A:AZIN protein expression was detected by Western blot, 1.normal prostate tissue, 2.prostate cancer tissue, 3.prostate PC3 cells; B: relative expression of AZIN;*P<0.05 compared with normal prostate tissue

*P<0.01 compared with no siRNA and scramble siRNA圖2 siRNA-AZIN在mRNA水平下調(diào)AZIN表達(dá)Fig 2 siRNA-AZIN down regulated the mRNA level of n=3)

*P<0.05 compared with no siRNA and scramble siRNA圖3 siRNA-AZIN在蛋白水平下調(diào)AZIN和ODC的表達(dá)Fig 3 siRNA-AZIN down regulated the protein level of AZIN and n=3)

2.3 siRNA-AZIN在蛋白水平下調(diào)AZIN和ODC的表達(dá)

相對(duì)于空白組(no siRNA)和陰性對(duì)照組(scramble siRNA)，oligo- 877(siRNA1)和 oligo- 1006(siRNA2)均可降低AZIN蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，且使ODC的表達(dá)水平降低(P<0.05)(圖3)。

2.4 AZIN表達(dá)下調(diào)影響前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖能力

相對(duì)于空白組(no siRNA)和陰性對(duì)照組(scramble siRNA)，oligo- 877(siRNA1)和 oligo- 1006(siRNA2)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力減弱，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，siRNA組增殖能力明顯減弱(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with no siRNA and scramble siRNA圖4 AZIN表達(dá)下調(diào)影響前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖Fig 4 Expression of AZIN down-regulates the prolifer-

3 討論

ODC表達(dá)上調(diào)和多胺在細(xì)胞的積聚與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[8]。ODC的表達(dá)受多種因素的調(diào)節(jié)，其中ODC/多胺/AZ負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路發(fā)揮重要作用。細(xì)胞內(nèi)的AZ活性受到AZIN的調(diào)控，因?yàn)锳ZIN與AZ的親和力比AZIN和ODC的親和力高，可使ODC從ODC和AZ的復(fù)合物中解離出來(lái)。最終導(dǎo)致ODC的產(chǎn)生量增加，此外，AZIN還可穩(wěn)定新合成的ODC。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA下調(diào)AZIN的表達(dá)后，AZ在mRNA和蛋白水平的表達(dá)都無(wú)明顯變化，可能是AZIN降低了AZ的活性，但對(duì)AZ的表達(dá)量無(wú)明顯影響，但AZIN的表達(dá)下調(diào)使ODC的表達(dá)量降低，最終抑制前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖。

總之，本結(jié)果表明,用siRNA-AZIN可有效減少前列腺癌細(xì)胞中AZIN的表達(dá)水平，最終導(dǎo)致ODC表達(dá)量的降低及細(xì)胞抑制。提示調(diào)節(jié)AZIN可作為腫瘤，尤其是前列腺癌治療的潛在靶標(biāo)。

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新聞點(diǎn)擊

心力衰竭蛋白質(zhì)與早期腦部損傷有關(guān)

據(jù)美國(guó)WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 12- 17)報(bào)道，一篇新研究認(rèn)為，特定心臟病蛋白質(zhì)的高血中濃度與腦部損傷相關(guān)。

N端前B型利鈉勝肽(NT-proBNP)是應(yīng)對(duì)心臟壁壓力而釋放到血液中的一種蛋白質(zhì)。當(dāng)心力衰竭惡化時(shí)，血中的NT-proBNP值上升，當(dāng)心力衰竭狀況緩解時(shí)，此數(shù)值則降低。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，心臟病和腦部疾病之間有關(guān)聯(lián)，但是不清楚NT-proBNP的作用。

荷蘭的研究者探討近2 400名中年與年長(zhǎng)的無(wú)癡呆癥心臟病患者，發(fā)現(xiàn)血中NT-proBNP值與MRI測(cè)得的腦部損傷之間有明確關(guān)聯(lián)，但是，這篇研究并未證實(shí)這個(gè)蛋白質(zhì)的濃度較高時(shí)會(huì)引起腦部損傷。

這篇研究在線發(fā)表于2016年12月7日的《放射醫(yī)學(xué)》(Radiology)。