趙延兵，張　瑋，趙巧云，秦　雯，蘇瑜恒，牛馨苗

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的原發(fā)性癌和最常見的實(shí)性腫瘤[1]。由于肝細(xì)胞癌的侵襲而造成的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移顯著降低了相當(dāng)一部分肝癌患者的治療效果[2]。最新的研究結(jié)果表明，大量的miRNA在HCC中被釋放，miRNA直接或間接地通過靶向轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白來調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移。miR-181-5p已經(jīng)被證明在幾種癌癥中下調(diào)[3]。然而，對(duì)于miR-181-5p在人肝癌中的作用機(jī)制和潛在的分子機(jī)制知之甚少。本研究通過人肝癌標(biāo)本的免疫組化染色、qRT-PCR和體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染、免疫熒光染色、蛋白印跡實(shí)驗(yàn)、平板克隆、Transwell和細(xì)胞活力檢測(cè)等，研究了miR-181-5p靶基因通過調(diào)控AKT3，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、增殖，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1材料人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，購于天津百塞斯生物科技公司；人肝癌組織收集于焦作市人民醫(yī)院病理科；1640培養(yǎng)基購于Gbico公司；小牛血清購于美國Gbico公司；兔抗鼠AKT3、N-cadherin、E-cadherin抗體以及羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購于美國CST公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒均購于全式金生物科技公司。免疫組化試劑盒購于天津麥蘭伯生物科技公司；免疫熒光二抗，購于美國abcam公司。Transwell小室和Matrigel基底膠購于美國BD公司；AKT3 siRNA、miR-181-5p mimic或inhibitor購于廣州銳博生物科技公司。

1.2miR-181-5p和AKT3含量檢測(cè)Trizol法提取總RNA， miRNA專用提取試劑盒提取肝組織miRNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照熒光定量PCR試劑盒說明書配置PCR體系，然后上機(jī)。PCR 結(jié)果計(jì)算方法是：目的基因定量=2-△△CT，而△CT =CT目的基因-CT內(nèi)參，△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)組-△CT對(duì)照組。

1.3AKT3、E-cadherin和N-cadherin表達(dá)人肝癌組織用4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)經(jīng)過梯度酒精、二甲苯脫水制作組織蠟塊、切片。兩組分別經(jīng)過免疫組化染色，顯微鏡下觀察AKT3、E-cadherin和N-cadherin表達(dá)量。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染將SMMC-7721肝癌細(xì)胞接種至六孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞密度50%～70%。NC組每孔加入10 μL miRNA-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞；mimic組每孔加入10 μL miRNA-mimic；inhibitor組每孔加入10 μL miRNA-inhibitor；inhibitor+siRNA AKT3組在轉(zhuǎn)染inhibitor的同時(shí)加入siRNA AKT3轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5肝癌細(xì)胞增殖能力檢測(cè)待siRNA NC組、inhibitor+siRNA NC組和inhibitor+siRNA AKT3組細(xì)胞密度至80%～90%時(shí)，分別胰酶消化、重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度，于六孔板中培養(yǎng)，每組做3個(gè)復(fù)孔。放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3遍，0.5%結(jié)晶紫染色后肉眼直接計(jì)數(shù)每孔的克隆數(shù)[4]。

1.6肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力待siRNA NC組、inhibitor+siRNA NC組和inhibitor+siRNA AKT3組SMMC-7721細(xì)胞密度至80%～90%時(shí)，分別胰酶消化、1%培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至105·mL-1。在24孔板中加入10%培養(yǎng)基，每孔600 μL。將Transwell小室(加Matrigel膠小室用于觀察SMMC-7721細(xì)胞侵襲能力，不加Matrigel膠小室用于觀察腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力)放入24孔板中，每組吸取100 μL細(xì)胞懸液分別加入加膠和不加膠的小室中，每組做3個(gè)復(fù)孔。放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。棄去培養(yǎng)基，取出小室，用0.1%結(jié)晶紫染液室溫染色3 h[5]。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

2　結(jié)果

2.1miR-181-5p、AKT3表達(dá)量和相關(guān)性qRT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組((miR-181-5p (16.6±3.7)，AKT3 (10.6±3.9))相比較，miR-181-5p在人肝癌組織中呈低表達(dá)(8.7±3.6)，而AKT3高表達(dá)(17.3±3.5)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-181-5p與AKT3在肝癌組織中相關(guān)性較高(r2=0.636 5，P<0.05)；免疫組化結(jié)果顯示在miR-181-5p高表達(dá)的肝癌組織中AKT3、E-cadherin、N-cadherin陽性染色較miR-181-5p低表達(dá)的肝癌組織減弱，見圖1。

A、B：PCR測(cè)定miR-181-5p和AKT3在人肝癌組織與正常肝組織表達(dá)水平(①P<0.05)；C：miR-181-5p和AKT3在肝癌組織中的相關(guān)性；D：免疫組化顯示miR-181-5p高表達(dá)肝癌組織和miR-181-5p低表達(dá)的肝癌組織中AKT3、E-cadherin和N-cadherin表達(dá)分布情況。圖1　各組肝組織miR-181-5p、AKT3表達(dá)及miR-181-5p與AKT3相關(guān)性

2.2miR-181-5p靶向抑制AKT3Transwell結(jié)果顯示：與NC組細(xì)胞侵襲數(shù)目96.7±11.4相比較，抑制miR-181-5p活性，細(xì)胞侵襲數(shù)目為246.7±27.7，肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)；敲除AKT3后，細(xì)胞侵襲數(shù)目為128.9±10.8，肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力降低(P<0.05)；平板克隆結(jié)果顯示：NC組細(xì)胞數(shù)目為106.2±8.3，抑制miR-181-5p活性，細(xì)胞數(shù)目為391.2±12.3，肝癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，而敲除AKT3后，細(xì)胞數(shù)目為124.5±10.1，肝癌細(xì)胞的增殖能力降低(P<0.05)。

A：Transwell顯示肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力；B:計(jì)數(shù)各組細(xì)胞數(shù)(①與NC組比較，P<0.05)。C：平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞增殖能力;D:計(jì)數(shù)各組細(xì)胞集落數(shù)(②與inhibitor+siRNA NC組比較，P<0.05)。圖2　miR-181-5p靶向抑制AKT3對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移和增殖能力的影響

3　討論

miR-181家族的成員miR-181-5p已被證明在多種腫瘤中低表達(dá)，包括乳腺癌[6]、結(jié)直腸癌[7]、肺癌、胃癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌[8]，但其確切的分子機(jī)制仍然未知。作者采用qRT-PCR檢測(cè)人肝癌標(biāo)本中miR-181-5p表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-181-5p在人肝癌組織中表達(dá)量明顯減少。同時(shí)，通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)在miR-181-5p高表達(dá)組肝癌組織中AKT3、E-cadherin和N-cadherin表達(dá)量較miR-181-5p低表達(dá)組的肝癌組織中低，說明在肝癌細(xì)胞模型中miR-181-5p高表達(dá)能顯著降低肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖的能力，反之能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖的能力。

上述的研究中發(fā)現(xiàn)了miR-181-5p能抑制肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，但是其作用機(jī)制仍然未知。作者通過TargetScan預(yù)測(cè)了miR-181-5p與自噬相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白AKT3高度相關(guān)，于是設(shè)想，miR-181-5p是否通過AKT3調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞EMT，進(jìn)一步影響肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移？有證據(jù)表明，miR-181家族成員通過EMT途徑發(fā)揮作用。EMT觸發(fā)上皮細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)記物，并下調(diào)上皮標(biāo)志物表達(dá)[9]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是一種上皮分子標(biāo)記物，其負(fù)責(zé)建立黏附連接處，在頂面下方形成連續(xù)的黏合帶[10-12]。由EMT引起的E-鈣黏蛋白的損失導(dǎo)致細(xì)胞間的接合脫落，并降低黏附力[13-15]。Transwell結(jié)果顯示：抑制miR-181-5p活性，肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，敲除AKT3后肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力降低；平板克隆結(jié)果顯示：抑制miR-181-5p活性，肝癌細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，敲除AKT3后肝癌細(xì)胞的增殖能力降低。

以上結(jié)果表明miR-181-5p靶基因通過靶向調(diào)控AKT3，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、增殖和生存能力。因此，miR-181-5p靶向調(diào)控AKT3抑制自噬有望成為干預(yù)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的新策略。

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