王 磊 ，秦新潮 ，林漢成 ，鄧愷飛 ，羅儀文 ，孫其然 ，杜秋香 ，王振原 ，托 婭 ，孫俊紅

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；3.上海健康醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201318；4.渭南市公安局臨渭分局，陜西 渭南 714000；5.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061）

死亡時(shí)間為案件定性和偵查提供關(guān)鍵信息，因此明確死亡時(shí)間對法醫(yī)極為重要[1-3]。目前，國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者提出了多種死亡時(shí)間推斷方法，如體液生物化學(xué)、超生反應(yīng)、代謝組學(xué)、影像學(xué)和遺傳物質(zhì)降解規(guī)律等方法[4-6]。但是，在實(shí)踐中由于尸體受到溫度、濕度、動物昆蟲和人為因素等多種因素的影響，使得準(zhǔn)確推斷死亡時(shí)間仍是法醫(yī)學(xué)難題之一[2，7-8]。

本課題組前期研究[9-11]分析了死后大鼠脾等組織傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜檢測數(shù)據(jù)，利用吸光度峰強(qiáng)變化和死亡時(shí)間的關(guān)系推斷死亡時(shí)間，提出了新的死亡時(shí)間推斷方法。FTIR光譜技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測物質(zhì)基團(tuán)化學(xué)鍵的振動，全面反映組織的特征信息，由于其檢測靈敏度高、特異性好、操作簡便等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用[12-13]。

隨著數(shù)據(jù)挖掘和計(jì)算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，數(shù)據(jù)挖掘算法成為目前最先進(jìn)的光譜學(xué)分析手段[12]。其中，偏最小二乘法（partial least squares，PLS）是基于多元線性回歸和主成分回歸法發(fā)展起來的多元算法，具有模型預(yù)測能力強(qiáng)、可利用較少樣本處理多變量和模型相對簡單等優(yōu)點(diǎn)，可對數(shù)據(jù)進(jìn)行定性（分類判別）或定量（回歸）分析[12，14]。 支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）是基于統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)理論的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，專門針對小樣本建立的統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)方法，同時(shí)適用于線性和非線性數(shù)據(jù)集合的分析[15]。本研究在光譜學(xué)研究基礎(chǔ)上引入數(shù)據(jù)挖掘算法，深度挖掘生物組織光譜信息，建立死亡時(shí)間定性和定量判別模型，為準(zhǔn)確推斷死亡時(shí)間建立新方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組及取材

成年雄性大鼠10只（由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供），體質(zhì)量（260±20）g，室溫飼養(yǎng) 2d 后脫臼法處死，置于 20 ℃環(huán)境中。 于處死后 0、6、12、24、48、72、96、120、144、168 h，分別取每只大鼠 1 mm×1 mm×1 mm的脾組織放入液氮中保存。每只大鼠脾組織樣本重復(fù)收集。

1.2 FTIR檢測

取出液氮中保存組織置于衰減全反射（attenuated total reflectance，ATR）探頭硒化鋅晶體表面，下壓ATR探頭上的杠桿擠壓大鼠脾組織，使之緊密貼附于晶體表面。擠壓后脾組織用電吹風(fēng)（冷風(fēng)）吹干進(jìn)行光譜采集。用尼高力6700傅里葉變換紅外光譜儀（美國 Thermo Fisher Scientific公司）在 4000～900cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，分辨率為4cm-1，每個(gè)樣本累計(jì)掃描20次。

1.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理

光譜預(yù)處理采用Unscrambler X 10.4軟件（挪威CAMO公司）。FTIR檢測數(shù)據(jù)采用平滑處理法（包括5點(diǎn)、15點(diǎn)和25點(diǎn)平滑處理法）去除噪聲；二階導(dǎo)數(shù)算法以提高分辨率、增大信息量，有效地分辨光譜圖中的重疊峰；歸一化處理以校正由微小光程差引起的光譜變化；多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量（standard normal variate，SNV）校正方法有效消除組織表面顆粒大小、表面散射以及光程差變化等問題。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Matlab R2014a軟件的PLS Toolbox 8.1.1工具箱（美國MathWorks公司）對預(yù)處理后的FTIR檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、支持向量機(jī)分類（support vector machine classification，SVMC）和偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取8個(gè)樣本的光譜數(shù)據(jù)建立校正集，其余2個(gè)樣本光譜數(shù)據(jù)為預(yù)測集，采用留一法交叉驗(yàn)證建立死亡時(shí)間PLS-DA、SVMC判別模型（定性）和PLS回歸模型（定量）。

PLS回歸模型中決定系數(shù)（R2）、校正均方根誤差（root mean square error of calibration，RMSEC）以及交叉驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error of crossvalidation，RMSECV）都是校正模型評估參數(shù)，評估模型質(zhì)量。預(yù)測均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）是模型外部驗(yàn)證參數(shù)，評估模型預(yù)測效果。

結(jié)合法醫(yī)學(xué)實(shí)踐與PCA結(jié)果，進(jìn)一步細(xì)分死亡時(shí)間范圍，選取不同的分類方法進(jìn)行死亡時(shí)間的PLSDA分析。分類方法包括七分類法（分為0～24h、48h、72 h、96 h、120 h、144 h 和 168 h）、四分類法（分為 0～24 h、48～72 h、96～120 h 和 144～168 h）、三分類法（分為 0～24h、48～72h 和 96～168h）和二分類法（分為 0～24 h、48～168h）。 通過 Matlab R2014a 軟件計(jì)算得出判別模型的準(zhǔn)確率及未識別樣本數(shù)，其中準(zhǔn)確率是模型識別正確的樣本數(shù)占識別樣本數(shù)的百分比。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果

在4 000～900 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)測定大鼠脾組織FTIR光譜圖譜，由于FTIR檢測數(shù)據(jù)在2500～1800cm-1波數(shù)范圍內(nèi)缺乏有效的生物學(xué)信息，為減少誤差，后續(xù)的研究中去掉該段波數(shù)（圖1）。

圖1 平滑、SNV預(yù)處理后大鼠脾組織的光譜圖

2.2 PCA結(jié)果

原始FTIR檢測數(shù)據(jù)經(jīng)過5點(diǎn)平滑處理，進(jìn)行PCA，選取主成分?jǐn)?shù)不超過10個(gè)。PCA顯示，主成分1、主成分2和主成分3反映了總體數(shù)據(jù)變異的96%。如圖2所示，各實(shí)驗(yàn)組的FTIR檢測數(shù)據(jù)基本上可以聚為 0～24 h、48～72 h 和 96～168 h。 其中，0～24 h 與48～72h兩個(gè)時(shí)間段的FTIR檢測數(shù)據(jù)在PCA得分圖上部分重合，而96～168h組數(shù)據(jù)與其他兩個(gè)時(shí)間段光譜數(shù)據(jù)界限清晰。

圖2 FTIR檢測數(shù)據(jù)在前三個(gè)主成分上的得分三維圖

2.3 定性分析

2.3.1 預(yù)處理方法對PLS-DA結(jié)果的影響

FTIR檢測數(shù)據(jù)經(jīng)平滑、歸一化、MSC、SNV預(yù)處理后，留一法交叉驗(yàn)證后獲得最佳潛變量（latent variable，LV），以建立PLS-DA預(yù)測模型，模型校正集和預(yù)測集結(jié)果如表1所示。在多種預(yù)處理結(jié)果中，二階導(dǎo)數(shù)算法計(jì)算后，PLS-DA模型校正集和預(yù)測集準(zhǔn)確率都為100%，且模型校正集準(zhǔn)確率在所有預(yù)處理結(jié)果中最高；模型校正集和預(yù)測集未識別樣本數(shù)都較低，分別為3和0。因此，二階導(dǎo)數(shù)算法是建立PLS-DA預(yù)測模型的最佳預(yù)處理方法。

2.3.2 波段對PLS-DA結(jié)果的影響

根據(jù)2.3.1分析結(jié)果，F(xiàn)TIR檢測數(shù)據(jù)采用二階導(dǎo)數(shù)算法計(jì)算，分別選取 1800～900cm-1、4000～2500cm-1以及 1 800～900 cm-1和 4 000～2 500 cm-1聯(lián)合分析比較。結(jié)果如表2所示，聯(lián)合應(yīng)用1 800～900 cm-1和4000～2500cm-1分析時(shí)，PLS-DA模型校正集準(zhǔn)確率達(dá)到100%，同時(shí)未識別樣本數(shù)較低，分別為5和0。因此，1800～900cm-1和 4000～2500cm-1聯(lián)合分析最適合本研究。

表1 預(yù)處理方法對PLS-DA結(jié)果的影響

表2 波段對PLS-DA結(jié)果的影響

2.3.3 分類對PLS-DA結(jié)果的影響

綜合法醫(yī)實(shí)踐和PCA數(shù)據(jù)特征，本研究選擇了四種分類方法將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步細(xì)分為不同類別進(jìn)行PLS-DA分析。FTIR檢測數(shù)據(jù)PLS-DA判別模型在四分類、三分類和二分類中準(zhǔn)確率都達(dá)到100%，且未識別樣本數(shù)較低，均不超過2個(gè)，遠(yuǎn)低于七分類的13個(gè)（表3）。證明PLS-DA可以將不同死亡時(shí)間點(diǎn)FTIR檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行有效分類，尤其可將死亡時(shí)間準(zhǔn)確劃分為 0～24h、48～72h、96～120h 和 144～168 h，這一結(jié)果對死亡時(shí)間推斷具有重要的實(shí)踐意義。如圖3所示，在PLS-DA分析中，各實(shí)驗(yàn)組FTIR檢測數(shù)據(jù)基本上可以被分為 0～24h、48～72h、96～120h 和 144～168h。

表3 分類對PLS-DA結(jié)果的影響

圖3 不同分類變量的PLS-DA結(jié)果

2.3.4 預(yù)處理方法對SVMC結(jié)果的影響

由表4可知，與原始數(shù)據(jù)相比，平滑、SNV和二階導(dǎo)數(shù)算法處理后，SVMC模型校正集和預(yù)測集準(zhǔn)確率提升不明顯，歸一化和MSC處理后模型準(zhǔn)確率（95%和94%）提升較多，且MSC處理后模型預(yù)測準(zhǔn)確率（95%）最高。因此，MSC是最適合SVMC分析的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法。

2.3.5 分類對SVMC結(jié)果的影響

分類依據(jù)及方法同PLS-DA分析，對FTIR檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行SVMC分析（表5）。SVMC分析中二分類或三分類模型準(zhǔn)確率較高，校正集和預(yù)測集準(zhǔn)確率都穩(wěn)定在95%左右，但是對于四分類或七分類效果明顯下降。同時(shí)，比較PLS-DA和SVMC兩種算法，所有分類中，PLS-DA模型校正集和預(yù)測集準(zhǔn)確率都高于SVMC分析，甚至部分分類的PLS-DA模型準(zhǔn)確率為100%，遠(yuǎn)高于SVMC分析準(zhǔn)確率。

表4 預(yù)處理方法對SVMC結(jié)果的影響（%）

表5 不同分類下SVMC和PLS-DA結(jié)果比較（%）

2.4 定量分析

校正集和預(yù)測集的建立方法同定性分析，LV不超過10個(gè)，F(xiàn)TIR檢測數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后建立PLS回歸模型。結(jié)果如表6所示，與原始數(shù)據(jù)相比，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正預(yù)處理后模型交叉驗(yàn)證決定系數(shù)（R2）最高（0.96），RMSEC和 RMSECV 都較低，分別為 9.90h和11.39 h，校正集決定系數(shù)（R2）達(dá)到 0.97，RMSEP 較低，數(shù)值為10.49h。因此，在PLS回歸分析中選取標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正作為預(yù)處理方法。圖4為PLS回歸模型預(yù)測結(jié)果，模型決定系數(shù)（R2）為0.97，RMSEP為10.49h。

圖4 PLS回歸模型預(yù)測結(jié)果

3 討 論

本研究利用FTIR光譜技術(shù)檢測大鼠死后脾組織不同時(shí)間點(diǎn)的變化，與既往[16-17]光譜分析相比，此次實(shí)驗(yàn)最大優(yōu)勢在于引入數(shù)據(jù)挖掘算法和大數(shù)據(jù)分析軟件，深度挖掘FTIR檢測數(shù)據(jù)信息建立有效的定性、定量分析數(shù)學(xué)模型，以準(zhǔn)確推斷死亡時(shí)間。

PCA 將光譜樣本聚為 0～24h、48～72h 和 96～168h，說明這三個(gè)時(shí)間段的大鼠脾組織FTIR檢測數(shù)據(jù)之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與之前的研究結(jié)果[16]一致。其中，0～24h與48～72h FTIR檢測數(shù)據(jù)在PCA得分圖上部分重合，一方面可能是由于死后24h以內(nèi)屬于早期死亡[2]，組織腐敗不明顯或部分腐敗組織與死后48～72 h快速腐敗分解的大鼠脾組織的化學(xué)組分相似，另一方面由于死后生物組織的降解轉(zhuǎn)化與組織內(nèi)化學(xué)組分（如組織蛋白脂肪比、水分、無機(jī)鹽及礦物質(zhì)的含量等）和生物酶活性等因素相關(guān)[2，18]，死后組織的FTIR檢測數(shù)據(jù)特征具有個(gè)體差異。值得注意的是，死后96～168h的組織光譜在PCA得分圖上與其他兩個(gè)時(shí)間段組織光譜相距較遠(yuǎn)，幾乎沒有樣本重疊，說明該時(shí)間段脾組織的FTIR特征與其他時(shí)間段之間差異顯著。 根據(jù)目前的研究[2，16，19-20]，主要是由于死后晚期脾組織嚴(yán)重降解，微生物繁殖演替，脾組織內(nèi)物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì)。

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，部分案件需要法醫(yī)根據(jù)尸體檢驗(yàn)以及案件調(diào)查情況對死亡時(shí)間劃定范圍，以認(rèn)定或排除嫌疑人。因此，應(yīng)用定性分析的方法對死亡時(shí)間進(jìn)行分類判別，即劃定死亡時(shí)間范圍，具有重要的法醫(yī)學(xué)意義。本研究中，不同死亡時(shí)間的脾組織FTIR檢測數(shù)據(jù)在PCA結(jié)果中具有明顯的聚類趨勢，為了將死亡時(shí)間范圍進(jìn)一步細(xì)分，彌補(bǔ)PCA的不足，在PCA結(jié)果的基礎(chǔ)上增加了分類以進(jìn)行PLS-DA分析。PLS-DA是將PLS回歸特性與判別能力相結(jié)合的線性分類方法，對FTIR檢測數(shù)據(jù)矩陣和類別矩陣之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析，其主要優(yōu)點(diǎn)是用LV對數(shù)據(jù)變異性進(jìn)行建模，可實(shí)現(xiàn)不同類型數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)關(guān)系的可視化[14]。本研究結(jié)果顯示，所有預(yù)處理后FTIR檢測數(shù)據(jù)PLS-DA準(zhǔn)確率接近99%，說明本研究中不同死亡時(shí)間段內(nèi)FTIR檢測數(shù)據(jù)特征差異顯著，與PCA結(jié)果吻合，也說明PLS-DA算法適合本研究FTIR檢測數(shù)據(jù)類型。為比較PLS-DA模型的判別能力，我們將FTIR檢測數(shù)據(jù)分為不同類別進(jìn)行判別分析。其中四分類（0～24h、48～72h、96～120h 和 144～168h）的 PLS-DA 模型準(zhǔn)確率為100%，未識別樣本較少。此外，雖然三分類和二分類模型準(zhǔn)確率都較高，但是分類變量少，對死亡時(shí)間范圍劃分過寬導(dǎo)致其實(shí)際意義有限。因此，PLS-DA四分類模型較其他分類模型能更準(zhǔn)確地劃分死亡時(shí)間范圍，對死亡時(shí)間的推斷具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

SVMC是一種新的模式識別方法，已表現(xiàn)出許多優(yōu)于其他模式識別方法的性能[21]。SVMC方法將待解決的模式識別問題轉(zhuǎn)化成為一個(gè)二次規(guī)劃尋優(yōu)問題，在理論上保證了全局最優(yōu)解，避免了局部收斂現(xiàn)象[22]。近紅外光譜法結(jié)合SVMC在中草藥和石油的分類和鑒別上得到了成功應(yīng)用[22]。結(jié)果顯示，SVMC對死后大鼠脾組織FTIR檢測數(shù)據(jù)可實(shí)現(xiàn)較理想的三分類（0～24h、48～72h 和 96～168h）推斷，其外部驗(yàn)證準(zhǔn)確率達(dá)到95%，判別能力略低于PLS-DA，但對死亡時(shí)間推斷仍具有重要的實(shí)踐意義。

定性判別對死亡時(shí)間段進(jìn)行了大致劃分，可初步推斷死亡時(shí)間范圍。為提高死亡時(shí)間推斷的精確度，我們對FTIR檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行了PLS回歸分析。PLS回歸模型的外部驗(yàn)證結(jié)果顯示其決定系數(shù)為0.97，證明死亡時(shí)間與組織FTIR檢測數(shù)據(jù)之間高度相關(guān)。RMSEP為10.5h。由于本研究設(shè)置了多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，死后時(shí)間最長為168h，且在24h以后相鄰時(shí)間點(diǎn)間隔為24h，所以本研究的PLS回歸模型對于死亡晚期（＞24h）的推斷具有更高的參考價(jià)值。

綜上所述，本研究基于FTIR技術(shù)和數(shù)據(jù)挖掘方法，在PCA結(jié)果的基礎(chǔ)上分別利用PLS-DA、SVMC和PLS回歸算法建立了死亡時(shí)間推斷模型，這些模型能準(zhǔn)確識別或預(yù)測不同死亡時(shí)間大鼠脾組織，表明利用FTIR技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)挖掘方法進(jìn)行死亡時(shí)間推斷這一思路是可行的，為在法醫(yī)實(shí)踐中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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