陳 揚(yáng) ，季心怡 ，范琰琰 ，喻林升

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 溫州 325035）

損傷時(shí)間準(zhǔn)確推斷能為判斷案情提供線索和依據(jù)，一直是法醫(yī)學(xué)界研究的重要課題。傳統(tǒng)的損傷時(shí)間推斷方法主要是肉眼觀察和組織學(xué)檢查。近年來(lái)，為了更精確地推斷損傷時(shí)間，尋找與損傷經(jīng)歷時(shí)間具有良好相關(guān)性的指標(biāo)成為法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，方法主要有運(yùn)用免疫組織化學(xué)或Western印跡法檢測(cè)創(chuàng)口中蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)或原位雜交技術(shù)對(duì)創(chuàng)口中基因水平進(jìn)行研究等。

皮膚創(chuàng)口愈合是一個(gè)多細(xì)胞、多分子參與的復(fù)雜過(guò)程，可分為炎癥、增殖和再塑三個(gè)階段。在炎癥階段，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)至創(chuàng)口，產(chǎn)生活性氧及氧化應(yīng)激[1-2]，并釋放促炎細(xì)胞因子。此后，成纖維細(xì)胞開(kāi)始大量增殖并分化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生膠原纖維沉積于創(chuàng)口內(nèi)，與新生的毛細(xì)血管構(gòu)成肉芽組織，最終經(jīng)過(guò)改建和再塑轉(zhuǎn)變?yōu)轳：劢M織。同時(shí)，表皮細(xì)胞增生覆蓋創(chuàng)口，使創(chuàng)口愈合。在皮膚創(chuàng)口愈合期間，大量細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子參與其中。

叉頭框（forkhead box，F(xiàn)ox）蛋白家族[3-4]是一類(lèi)DNA結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，來(lái)源于果蠅的“叉頭”突變，于1990年首次發(fā)現(xiàn)，至今已發(fā)現(xiàn)了90多種Fox基因，2000年被統(tǒng)一命名為轉(zhuǎn)錄因子家族，廣泛存在于從酵母到哺乳類(lèi)的真核生物中。Fox含17個(gè)亞家族，其中FoxO家族研究最為深入，F(xiàn)oxO1是FoxO亞家族中的主要成員之一。研究[5-9]證實(shí)，F(xiàn)oxO1在炎癥、氧化應(yīng)激、血管發(fā)生及成纖維細(xì)胞分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可能與皮膚創(chuàng)口愈合的進(jìn)程密切相關(guān)。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)和Western印跡法，檢測(cè)皮膚切創(chuàng)后不同時(shí)間段FoxO1的表達(dá)及其時(shí)間規(guī)律性，旨在探討FoxO1在皮膚損傷時(shí)間推斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制作及分組

成年C57BL/KsJ雄性小鼠45只（溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量25～30 g，隨機(jī)分為對(duì)照組和創(chuàng)傷形成后 6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d組，每組5只。創(chuàng)傷組小鼠在腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，背部皮膚剪毛處理，于背部中央做一長(zhǎng)1cm的皮膚全層縱向切口后進(jìn)行分籠飼養(yǎng)。分別于創(chuàng)口形成后 6h、12 h、1 d、3 d、5 d、7d、10d、14 d，將創(chuàng)傷組小鼠吸入乙醚麻醉后，脫頸椎處死，并以創(chuàng)口為中心，取創(chuàng)口及周邊處1.5cm×2.0cm大小的皮膚。對(duì)照組小鼠脫頸椎處死后，在與創(chuàng)傷組小鼠取材的相同部位取同等大小的皮膚樣本。

1.2 HE染色

每組樣本皮膚的1/2放入4%多聚甲醛溶液中固定12h，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，制成5μm厚的連續(xù)石蠟切片，將切片常規(guī)脫蠟及水化后采用蘇木素伊紅染液染色制成病理切片。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟及水化：（1）石蠟切片放置在60℃恒溫箱中烘烤 120min。（2）依次按二甲苯（20min）、二甲苯（20min）、無(wú)水乙醇（10min）、95%乙醇（10min）、90%乙醇（10 min）、80%乙醇（10 min）脫蠟和水化，微波熱修復(fù)法修復(fù)抗原。兔抗小鼠FoxO1單抗1∶100（2880，美國(guó)Cell Signaling Technology公司）作為一抗，按照Z(yǔ)LI-9018免疫組織化學(xué)染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。在正置顯微鏡（日本Nikon公司）下觀察，每張切片在創(chuàng)口周邊區(qū)隨機(jī)選擇10個(gè)視野，采用ImageJ2x軟件（美國(guó)National Institute of Health）計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及FoxO1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.4 Western印跡法檢測(cè)

冰浴上將各時(shí)間段剩余的1/2皮膚樣本剪碎，加蛋白裂解液（78833，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）300 μL及苯甲基磺酰氟（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）勻漿，超聲破碎，4℃下，以離心半徑10cm，12000r/min，離心 30min，吸取上清液，用 Lowry法測(cè)量蛋白濃度，將樣品置于-80℃保存，備用。變性5 min，進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF；德國(guó)Merck公司）上，轉(zhuǎn)膜條件為5V 40min。含有聚山梨酯的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽-吐溫20（tris buffered saline with tween-20，TBST）洗滌 3次，用 5%脫脂牛奶封閉 2 h，用兔抗小鼠 FoxO1單抗（1∶1 000）孵育，4℃過(guò)夜。TBST洗滌3次，羊抗兔IgG二抗（1∶2000）（中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescent，ECL）法顯色。 用 ImageJ2x 軟件分析各時(shí)間段條帶的光密度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，計(jì)算各組FoxO1蛋白表達(dá)的相對(duì)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 HE染色

中性粒細(xì)胞于傷后6h出現(xiàn)在創(chuàng)口周?chē)瑐?2h顯著增多；傷后1 d，單核細(xì)胞聚集于創(chuàng)口的邊緣，其數(shù)量于傷后3d增多，同時(shí)成纖維細(xì)胞也開(kāi)始出現(xiàn)在創(chuàng)口底部，傷后5 d增多，傷后7 d其數(shù)量達(dá)到高峰；傷后5～10d，肉芽組織形成，其內(nèi)可見(jiàn)大量的新生血管和成纖維細(xì)胞；傷后10d，表皮完全覆蓋創(chuàng)口；傷后14 d，損傷區(qū)新生血管和成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著減少，間質(zhì)增多，肉芽組織向瘢痕組織轉(zhuǎn)變（圖1）。

圖1 切創(chuàng)后皮膚組織HE染色結(jié)果（×400）

2.2 免疫組織化學(xué)染色

對(duì)照組皮膚，F(xiàn)oxO1弱表達(dá)于表皮、毛囊、皮脂腺、血管內(nèi)皮及真皮中少數(shù)的成纖維細(xì)胞。創(chuàng)傷組皮膚，傷后6 h可見(jiàn)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞表達(dá)FoxO1，傷后12 h表達(dá)FoxO1的中性粒細(xì)胞顯著增多，此后表達(dá)FoxO1的中性粒細(xì)胞顯著減少。傷后6～12h亦可見(jiàn)少量浸潤(rùn)的單核細(xì)胞表達(dá)FoxO1，傷后1～3 d表達(dá)FoxO1的單核細(xì)胞顯著增多，從傷后5d起表達(dá)FoxO1的單核細(xì)胞逐漸減少，傷后14 d的創(chuàng)口中僅可見(jiàn)少量FoxO1陽(yáng)性的單核細(xì)胞。傷后3d可見(jiàn)創(chuàng)口邊緣及底部有少量的成纖維細(xì)胞表達(dá)FoxO1，傷后5 d表達(dá)FoxO1的成纖維細(xì)胞顯著增多，于傷后7d達(dá)到峰值，傷后10～14d表達(dá)FoxO1的成纖維細(xì)胞顯著減少。傷后5～10d亦可見(jiàn)新生血管內(nèi)皮表達(dá)FoxO1，于傷后7d達(dá)到峰值（圖2）。

2.3 免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性細(xì)胞率分析

FoxO1免疫組織化學(xué)染色在對(duì)照組和創(chuàng)傷組中的陽(yáng)性細(xì)胞率見(jiàn)表1。FoxO1的陽(yáng)性細(xì)胞率（包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及成纖維細(xì)胞）于傷后7 d達(dá)到峰值。

2.4 Western印跡法檢測(cè)分析

以GAPDH（相對(duì)分子質(zhì)量約為34 000）為內(nèi)參，對(duì)照組及各創(chuàng)傷組均有FoxO1陽(yáng)性條帶，位于80000處。創(chuàng)傷后各時(shí)間段FoxO1表達(dá)強(qiáng)度有一定規(guī)律，傷后6 h表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng)，傷后12 h出現(xiàn)第一個(gè)表達(dá)高峰，傷后1～5d稍有下降，傷后7d FoxO1表達(dá)再次達(dá)到峰值，隨后表達(dá)逐漸降低，至傷后14d略高于對(duì)照組。各組FoxO1蛋白表達(dá)的相對(duì)水平見(jiàn)表2和圖3。

圖2 切創(chuàng)后皮膚組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

表1 小鼠皮膚切創(chuàng)后對(duì)照組和創(chuàng)傷組的細(xì)胞總數(shù)及FoxO1陽(yáng)性細(xì)胞率 （n=5，±s）

表1 小鼠皮膚切創(chuàng)后對(duì)照組和創(chuàng)傷組的細(xì)胞總數(shù)及FoxO1陽(yáng)性細(xì)胞率 （n=5，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 細(xì)胞總數(shù) FoxO1陽(yáng)性細(xì)胞率/% 出現(xiàn)的主要炎癥細(xì)胞對(duì)照 39.20±3.50 6.14±1.50 中性粒細(xì)胞6h 120.40±4.501） 21.55±1.211） 中性粒細(xì)胞12h 172.00±9.601） 30.34±2.561） 單核細(xì)胞1d 141.00±7.301） 34.66±3.381） 單核細(xì)胞3d 115.40±2.101） 37.87±3.131） 單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞5d 123.60±4.301） 41.20±5.171） 單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞7d 189.60±3.901） 52.56±6.361） 成纖維細(xì)胞10d 211.00±4.601） 21.36±3.201） 成纖維細(xì)胞14d 182.80±6.701） 7.40±3.341） 成纖維細(xì)胞

表2 FoxO1蛋白在對(duì)照組和創(chuàng)傷組中的相對(duì)表達(dá)量（n=5，±s）

表2 FoxO1蛋白在對(duì)照組和創(chuàng)傷組中的相對(duì)表達(dá)量（n=5，±s）

注：1）與相鄰上組比較，P＜0.05

組別 相對(duì)表達(dá)量對(duì)照 0.44±0.03 6h 2.26±0.091）12h 2.46±0.101）1d 1.05±0.041）3d 1.28±0.101）5d 1.59±0.091）7d 5.27±0.121）10d 1.53±0.061）14d 0.53±0.041）

圖3 對(duì)照組和創(chuàng)傷組皮膚組織FoxO1蛋白的表達(dá)

3 討 論

皮膚創(chuàng)口形成時(shí)間推斷在法醫(yī)學(xué)研究中一直是重點(diǎn)與難點(diǎn)。皮膚損傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的組織修復(fù)過(guò)程，包括氧化應(yīng)激、炎癥、血管發(fā)生、成纖維細(xì)胞增殖與分化、肉芽組織形成和纖維組織重建等，在該過(guò)程中有大量細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子參與[10-11]。

FoxO蛋白家族是一類(lèi)在動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、代謝等方面起著重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[4]。其中FoxO1是FoxO家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員，F(xiàn)oxO1蛋白包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域，依次為N端的forkhead區(qū)域（此區(qū)域同時(shí)也是DNA結(jié)合域）、核定位信號(hào)肽、核輸出序列和C端富含脯氨酸和絲（蘇）氨酸的轉(zhuǎn)錄激活域[12]。研究[5-9]證實(shí)，F(xiàn)oxO1在氧化應(yīng)激、炎癥、血管發(fā)生及成纖維細(xì)胞分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

HE染色顯示皮膚創(chuàng)口正常愈合。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，和對(duì)照組小鼠相比，傷后6～12h創(chuàng)口周邊區(qū)表皮及皮膚附件FoxO1表達(dá)增強(qiáng)，此外可見(jiàn)浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞表達(dá)FoxO1，提示FoxO1可能參與皮膚損傷后氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控。研究[13-14]表明，在創(chuàng)口愈合過(guò)程中，浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞可產(chǎn)生活性氧，與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)?？寡趸割?lèi)的表達(dá)也在創(chuàng)傷后有所增加，在創(chuàng)口的多個(gè)部位尤其是創(chuàng)緣表皮及毛囊周?chē)?，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶mRNA水平明顯升高[15-16]。PONUGOTI等[7]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1可以調(diào)節(jié)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶-2的表達(dá)，保護(hù)角質(zhì)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，這說(shuō)明FoxO1的表達(dá)增強(qiáng)可起到抗氧化應(yīng)激的作用。因此，傷后6～12h創(chuàng)口周邊區(qū)表皮及皮膚附件FoxO1表達(dá)增強(qiáng)可能與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。此外，在傷后1～3d的創(chuàng)口FoxO1以單核細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)為主，提示FoxO1可能參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控。研究[5]顯示，F(xiàn)oxO1在巨噬細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)可抑制其促炎介質(zhì)的釋放，表明FoxO1的表達(dá)可對(duì)炎癥反應(yīng)起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，傷后5～10d FoxO1在新生血管內(nèi)皮及成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)廣泛的表達(dá)，提示FoxO1可能參與皮膚創(chuàng)口愈合中的血管發(fā)生及成纖維細(xì)胞分化事件。ROUDIER等[8]研究表明，F(xiàn)oxO1可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凝血酶敏感蛋白-1的表達(dá)抑制血管發(fā)生。VIVAR等[9]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1可以刺激成纖維細(xì)胞表達(dá)FoxO1，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞。最新研究[17]顯示，F(xiàn)oxO1介導(dǎo)了角質(zhì)細(xì)胞對(duì)皮膚創(chuàng)口愈合的調(diào)節(jié)作用，敲除FoxO1后創(chuàng)口愈合能力受損，抑制了創(chuàng)口愈合期間的成纖維細(xì)胞增殖、肌成纖維細(xì)胞形成及膠原產(chǎn)生，這表明FoxO1可以通過(guò)調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖與分化促進(jìn)皮膚創(chuàng)口的愈合。

為了明確FoxO1蛋白表達(dá)的時(shí)序性變化，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western印跡法檢測(cè)了在皮膚切創(chuàng)后各時(shí)間段的FoxO1蛋白相對(duì)水平。結(jié)果顯示，對(duì)照組及各創(chuàng)傷組均有FoxO1陽(yáng)性條帶，損傷后FoxO1表達(dá)有其時(shí)間規(guī)律性，傷后6h表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng)，傷后12 h出現(xiàn)第一個(gè)表達(dá)高峰，傷后1～5d稍有下降，傷后7d FoxO1表達(dá)再次達(dá)到峰值，隨后表達(dá)逐漸降低，至傷后14d略高于對(duì)照組。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，在對(duì)照組皮膚，F(xiàn)oxO1弱表達(dá)于表皮、毛囊、皮脂腺、血管內(nèi)皮及真皮中少數(shù)的成纖維細(xì)胞。傷后12h創(chuàng)口有較多中性粒細(xì)胞表達(dá)FoxO1，此外創(chuàng)口周邊區(qū)表皮及皮膚附件FoxO1表達(dá)顯著增強(qiáng)。因此，中性粒細(xì)胞、表皮及皮膚附件表達(dá)FoxO1形成了傷后12h的表達(dá)峰值。傷后1～5 d，雖然創(chuàng)口中有較多單核細(xì)胞表達(dá)FoxO1，但FoxO1在表皮及皮膚附件中的表達(dá)強(qiáng)度減弱，因此FoxO1表達(dá)的整體水平有所下降。傷后7d是成纖維細(xì)胞增殖、分化及血管發(fā)生的高峰階段，創(chuàng)口中有大量的成纖維細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮表達(dá)FoxO1，此外亦可見(jiàn)較多單核細(xì)胞表達(dá)FoxO1，因此傷后7 d FoxO1表達(dá)再次達(dá)到峰值。傷后14d表達(dá)FoxO1的成纖維細(xì)胞和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞顯著減少，故FoxO1表達(dá)回落到略高于正常對(duì)照組的水平。

在以往推斷皮膚創(chuàng)口形成時(shí)間的研究[18]中，創(chuàng)口愈合相關(guān)性蛋白的表達(dá)峰值多在損傷1d后，且多呈單峰式變化趨勢(shì)。本研究Western印跡法結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO1蛋白在創(chuàng)口愈合期間出現(xiàn)兩個(gè)表達(dá)峰值，于傷后6h表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng)，傷后12h出現(xiàn)第一個(gè)表達(dá)高峰，傷后7d再次達(dá)到峰值，提示FoxO1表達(dá)可同時(shí)為早晚期損傷時(shí)間的推斷提供參考。尤其在傷后6h，創(chuàng)口中浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞較少，用傳統(tǒng)的組織學(xué)檢查難以準(zhǔn)確地推斷損傷時(shí)間，F(xiàn)oxO1的表達(dá)情況可用于參考。Western印跡法檢測(cè)僅較精確地反映出表達(dá)的整體水平，但FoxO1在兩個(gè)表達(dá)峰值前后的一些時(shí)間點(diǎn)的整體水平差異較小，故FoxO1用于創(chuàng)口形成時(shí)間推斷時(shí)需同時(shí)結(jié)合Western印跡法、免疫組織化學(xué)檢測(cè)及組織學(xué)特征進(jìn)行綜合評(píng)判，以縮小推斷的誤差。此外，對(duì)創(chuàng)口中FoxO1的表達(dá)是否受到死后變化的影響，將是我們進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

本研究證實(shí)，F(xiàn)oxO1在皮膚創(chuàng)口中不同類(lèi)型細(xì)胞呈現(xiàn)廣泛的表達(dá)，提示其密切參與了皮膚損傷愈合的進(jìn)程。皮膚損傷后FoxO1蛋白水平的時(shí)序性變化可望作為一種檢測(cè)指標(biāo)用于皮膚損傷時(shí)間的推斷。

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