楊 曉, 王明爽, 李紅葉

(浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院生物所，杭州 310012)

蛋白質(zhì)是生命活動的主要承擔(dān)者，其合成與降解的動態(tài)平衡，是細(xì)胞行使各種生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。真核細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)降解主要通過泛素蛋白酶系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasome system, UPS)[1]進(jìn)行，該系統(tǒng)由泛素分子(ubiquitin)、泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)以及 26S 蛋白酶體(Proteasome)組成。泛素連接酶 (Cullin-RING ubiquitin ligases, CRLs) 是 E3中最大的家族，它在真核生物的細(xì)胞生長、分化、繁殖、生物節(jié)律等生命過程中發(fā)揮重要作用[2]，一個典型的CRL復(fù)合體包括 Cullin 蛋白、RING 蛋白、調(diào)節(jié)蛋白和底物識別蛋白[3]。

COP9 信號復(fù)合體(COP9 signalosome, CSN)是真核細(xì)胞內(nèi)高度保守的多亞基蛋白復(fù)合物，最早作為光形態(tài)建成中重要的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn)于擬南芥中，它在黑暗環(huán)境下能抑制多種基因轉(zhuǎn)錄，隨后哺乳動物、果蠅、線蟲、酵母等真核生物中相繼發(fā)現(xiàn)CSN的存在。

CSN主要的生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)泛素介導(dǎo)的蛋白降解，目前已知的調(diào)控方式有4種：1)Nedd8是一種類泛素蛋白，它與Cullin蛋白結(jié)合后(稱為Neddylation)能加速CRLs復(fù)合體的組裝，促進(jìn)底物泛素化從而加速蛋白降解，而CSN作為一個異肽酶能將Nedd8從Cullin蛋白上切除，造成Cullin蛋白的脫Nedd8修飾(稱為Deneddylation)從而影響蛋白降解[4]；2)CSN能與CAND1配合來調(diào)控CRLs復(fù)合體的組裝、分解，維持CRLs組分的活性及穩(wěn)定性[5]；3)CSN能與CRLs復(fù)合體進(jìn)行物理結(jié)合，這會阻礙靶標(biāo)基質(zhì)與泛素結(jié)合酶E2的互作，從而降低CRLs復(fù)合體的活性[6]；4)CSN能與脫泛素酶UBP12/USP15結(jié)合來抑制CRLs組分的泛素化，從而維持 CRLs復(fù)合體的穩(wěn)定性[7]。

除調(diào)控泛素相關(guān)的蛋白降解外，CSN也參與多種生理生化過程的調(diào)節(jié)。在植物中，CSN參與調(diào)控光形態(tài)發(fā)生、花器官發(fā)育、信息素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物抗病性等眾多生理過程，在動物中，CSN參與調(diào)控細(xì)胞周期、腫瘤形成、心肌細(xì)胞存活等多種生命活動。高等真核生物中，任何一個CSN亞基的缺失突變株都會致死，而低等真核生物中，對應(yīng)的突變株能夠存活且遺傳信息能在子代中穩(wěn)定遺傳，因此真菌成為研究CSN在系統(tǒng)進(jìn)化、結(jié)構(gòu)組成、生物學(xué)功能方面的理想材料[8]。本文對真菌中CSN的結(jié)構(gòu)組成、生物學(xué)功能進(jìn)行了詳細(xì)介紹，以期為真菌及其他真核生物中CSN的研究提供一定的參考數(shù)據(jù)。

1 真菌CSN的亞基組成

傳統(tǒng)研究認(rèn)為CSN最多包含 8 個亞基，即CSN1-8，但最新研究發(fā)現(xiàn)CSN包含第九個亞基CSNAP[9-10]，其中CSN1-4，CSN7-8含有 PCI 結(jié)構(gòu)域(proteasome, COP9 Signalosome, initiation factor 3)，這6個亞基形成馬蹄形環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而CSN5和CSN6 含有MPN 結(jié)構(gòu)域(Mpr1-Pad1-N-teminal domain)，這2個亞基以異源二聚體的形式位于馬蹄環(huán)當(dāng)中[11]。另有研究認(rèn)為，CSN1/2/3/8 和CSN4/5/6/7是兩個相互對稱的模塊，兩者通過 CSN1 和 CSN6 間的互作進(jìn)行連接[12]。CSN中富含α螺旋的PCI結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)各亞基間的互作，使各亞基形成一個整體，而每個亞基的穩(wěn)定性又依賴于CSN整體的存在。

一些低等真核生物會缺少某些CSN亞基，甚至擁有自己獨特的亞基，說明CSN的亞基組成具有物種特異性[8]，擬南芥、人、小鼠和果蠅等真核生物的CSN包含8個亞基，秀麗隱桿線蟲的CSN缺少CSN8亞基。真菌中，釀酒酵母CSN的亞基組成最為特殊，包括CSN11、CSN10、RPN5、CSN5、CSI1和CSN9共6個亞基，分別是高等真核生物中CSN1、CSN2、CSN4、CSN5、CSN6和CSN7的同源亞基[13]，除CSN5外，其他各亞基與其同源亞基的同源性都非常低。裂殖酵母的CSN缺少CSN6、CSN8這2個亞基[14]，粗糙脈孢菌的CSN缺少CSN8亞基[15]，構(gòu)巢曲霉的CSN包含完整的8個亞基[16]。Barth等從進(jìn)化角度對61種真核生物的基因組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，包括復(fù)細(xì)胞動物、變形蟲和一些真菌在內(nèi)的真核生物中能夠檢測到CSNAP的同源亞基[10]。

2 真菌CSN的生物學(xué)功能

與高等真核生物不同，真菌CSN亞基缺失突變株不致死，而是出現(xiàn)各種異常的表型，主要表現(xiàn)在真菌的生長發(fā)育、生物鐘、代謝調(diào)控、敏感性、對細(xì)胞核物質(zhì)的影響、CSN的脫Nedd活性6個方面。目前真菌中CSN的研究對象包括釀酒酵母、裂殖酵母、粗糙脈胞菌和構(gòu)巢曲霉，此外其他真菌中暫無研究。鑒于CSN功能的保守性，真菌與其他真核生物中的研究成果可以相互啟發(fā)，一些無法在高等真核生物中展開的研究也可將真菌作為替代對象。

2.1 真菌的生長和發(fā)育

不同CSN亞基對真菌菌絲生長、子實體發(fā)育的作用不同。構(gòu)巢曲霉中，CSN4或CSN5缺失突變株雖能起始有性發(fā)育形成原基，但細(xì)胞壁和子囊孢子的進(jìn)一步分化和成熟受阻，并且在生長后期出現(xiàn)短且高度分枝的菌絲，說明CSN能影響構(gòu)巢曲霉的有性發(fā)育及菌絲的頂端延伸[17]。隨后Busch等補(bǔ)充發(fā)現(xiàn)，CSN1、CSN2及CSN5中的JAMM結(jié)構(gòu)域?qū)?gòu)巢曲霉的有性發(fā)育也非常重要[16]。除影響有性發(fā)育外，CSN也會影響有性發(fā)育和無性發(fā)育間的平衡，構(gòu)巢曲霉中PPOA、PPOC兩個基因能對類激素信號PSI因子進(jìn)行調(diào)控，其中PPOA促進(jìn)有性發(fā)育，PPOC促進(jìn)無性發(fā)育，CSN通過調(diào)控PPOA 和 PPOC 的比例來調(diào)節(jié)構(gòu)巢曲霉的有性發(fā)育和無性發(fā)育[18]。

粗糙脈孢菌的CSN包含CSN1-7共7個亞基，只有CSN3缺失突變株表型與野生型一致，其余各亞基的缺失都會使菌絲生長、分生孢子發(fā)育出現(xiàn)不同程度的缺陷[19]。Zhou等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，對CSN5 JAMM結(jié)構(gòu)域中關(guān)鍵位點(EXnHXHX10D)進(jìn)行點突變會破壞CSN的脫Nedd活性，但并不影響脈孢菌的生長發(fā)育，且點突變的CSN5亞基能恢復(fù)CSN5缺失突變株中的表型缺陷，說明對脈胞菌的生長發(fā)育而言，CSN的完整性比脫Nedd活性更重要[20]。

2.2 真菌的生物鐘

粗糙脈孢菌中，除CSN3外任何亞基的缺失突變株生理節(jié)律都表現(xiàn)出不同程度的缺陷，其中CSN2、CSN5的缺失使SCFFWD-1復(fù)合物中FWD1蛋白、CUL1蛋白的含量及穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致生物鐘蛋白FRQ的泛素化及降解受阻，從而出現(xiàn)異常的產(chǎn)孢節(jié)律。與此相反，CSN5 JAMM 結(jié)構(gòu)域的點突變株雖喪失脫Nedd活性，但生物鐘未受影響，說明對粗糙脈胞菌的生物鐘而言，CSN的完整性比脫Nedd活性更重要[15, 19-21]。值得一提的是，脈孢菌和動物中對生物鐘的調(diào)控是保守的，而人類Smith-Magenis綜合征病人中CSN3存在共同缺陷，根據(jù)脈胞菌中的研究成果推測，該病中生理節(jié)律混亂、睡眠擾亂的癥狀可能源于CSN功能的缺失。

2.3 真菌的代謝調(diào)控

Chen[22]和Licursi[23]等通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母CSN5缺失突變株中蛋白合成相關(guān)基因普遍上調(diào)、糖運輸相關(guān)基因明顯下調(diào)、氨基酸合成相關(guān)蛋白明顯增多，此外CSN5還參與脂類代謝、麥角甾醇合成相關(guān)基因的調(diào)控，其他CSN突變株中也存在相似的基因調(diào)控模式，說明CSN在釀酒酵母代謝中具有重要作用[22-23]。次級代謝與真菌發(fā)育密切相關(guān)，Nahlik[8]和Busch等[16-17]發(fā)現(xiàn)，敲除CSN4、CSN5或者對CSN5亞基JAMM活性核心中3個保守的氨基酸位點進(jìn)行定點突變，均會影響構(gòu)巢曲霉的次級代謝，其中CSN5的缺失會導(dǎo)致氧化還原酶相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)、發(fā)育過程中葡聚糖酶的激活受阻且細(xì)胞壁功能相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)、雜色曲霉素合成途徑失調(diào)、苷色酸及其衍生物的積累，具體表現(xiàn)為：突變株氧化壓力應(yīng)答受損并積累不常見的次級代謝產(chǎn)物，發(fā)育過程中細(xì)胞壁的重塑受阻，積累各種雜色曲霉素的中間產(chǎn)物及向培養(yǎng)基中釋放紅色物質(zhì)等。這些結(jié)果表明CSN5能協(xié)調(diào)多種代謝途徑來保證構(gòu)巢曲霉的生長發(fā)育正常進(jìn)行。

2.4 真菌的敏感性

真菌的敏感性既包括對激素等內(nèi)部信號的敏感程度，也包括對金屬離子、化學(xué)試劑、氧化壓力等外部信號的敏感程度。釀酒酵母中，不同的CSN缺失突變株對信息素的敏感程度不同，從而對交配效率產(chǎn)生不同的影響，這種影響與CSN的脫Nedd活性無關(guān)，具體表現(xiàn)為：與野生型菌株相比，CSN5、CSN9、CSN12缺失突變株交配效率提高了100%；CSN10、PCI8缺失突變株交配效率無變化；CSI1缺失突變株交配效率顯著降低[24]。此外，Licursi等發(fā)現(xiàn)釀酒酵母中CSN5能對鋅代謝相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，CSN5缺失突變株細(xì)胞內(nèi)鋅濃度增加且對培養(yǎng)基中低濃度的鋅、鎳、鎘變得敏感，突變株對酮康唑敏感性增強(qiáng)，對制霉菌素抗性增強(qiáng)[23]。

構(gòu)巢曲霉發(fā)育過程中CSN5的缺失會影響至少15%的基因的轉(zhuǎn)錄，并伴隨蛋白質(zhì)組的改變，導(dǎo)致突變株氧化還原調(diào)控受損并對氧化壓力高度敏感。此外，敲除CSN5或?qū)SN5 JAMM 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變均會增強(qiáng)突變株對激素的敏感性[8, 15]。

2.5 對細(xì)胞核物質(zhì)的影響

核苷酸還原酶是由2個大亞基(CDC22)和2個小亞基(SUC22)組成的異質(zhì)四聚體，一般情況下CDC22位于細(xì)胞質(zhì)，而SUC22被錨定蛋白SPD1固定于細(xì)胞核，大小亞基分離，一旦細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制，錨定蛋白SPD1將被泛素蛋白酶系統(tǒng)降解，使細(xì)胞核中的SUC22釋放到細(xì)胞質(zhì)中從而與CDC22結(jié)合成有活性的核苷酸還原酶。裂殖酵母中CSN1或CSN2的缺失會阻礙錨定蛋白SPD1的泛素化及降解，使SUC22與CDC22無法結(jié)合成完整的核苷酸還原酶，導(dǎo)致突變株S階段延遲并對DNA損傷、UV變得敏感，過量表達(dá)SUC22或敲除SPD1均能恢復(fù)這些表型缺陷，再次證明CSN能影響核苷酸還原酶的活性[14, 25]。此外，CSN能與Brc1以一種獨立且互補(bǔ)的方式在裂殖酵母DNA損傷修復(fù)及基因組穩(wěn)定性方面共同發(fā)揮作用[26]，且CSN1、CSN2 的缺失會使異染色質(zhì)產(chǎn)生缺陷[27]，而其他的CSN缺失突變株沒有可識別的表型。

面對不同的DNA損傷藥劑，構(gòu)巢曲霉野生型菌株中CSN4、CSN5的mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)且含量增加，而CSN4、CSN5缺失突變株生長減慢且對DNA損傷藥劑變得敏感，說明CSN與構(gòu)巢曲霉DNA損傷應(yīng)答相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DNA損傷應(yīng)答過程中CSN4、CSN5與NPKA、UVSBATR存在遺傳互作[28]。

2.6 CSN的脫Nedd活性

釀酒酵母中的CSI1與哺乳動物中的CSN6功能相同，CSI1中的S6CD 結(jié)構(gòu)域與CSN6中的羧基末端有明顯的同源性但缺少氨基末端的MPN--結(jié)構(gòu)域，這并不影響釀酒酵母CSN的脫Nedd活性[29]，但任何一個CSN亞基的缺失都會使釀酒酵母喪失脫Nedd活性[24]。對哺乳動物CSN6突變株(包含羧基末端的S6CD結(jié)構(gòu)域，但缺少MPN--結(jié)構(gòu)域)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，MPN--結(jié)構(gòu)域的缺失不會影響CSN的組裝及脫Nedd活性，這與釀酒酵母中的情況相同[29]，再次說明MPN--結(jié)構(gòu)域?qū)τ诿揘edd活性是非必需的。此外，Cirigliano等經(jīng)過一系列研究和驗證發(fā)現(xiàn)了2種未命名的小分子片段能夠抑制釀酒酵母CSN5的脫Nedd活性[30]。

裂殖酵母中CSN1-5均會影響CUL1蛋白和CUL3蛋白的Nedd化狀態(tài)[14]，但只有CSN1 和CSN2 會影響CUL4蛋白的Nedd化狀態(tài)[25]，說明CSN對不同的Cullin蛋白有不同的作用機(jī)制。此外，CSN能協(xié)助脫泛素酶UBP12p定位于細(xì)胞核中的Cullin蛋白，從而維持CRLs的穩(wěn)定[31]。

粗糙脈孢菌中除CSN3外，其他任何亞基的缺失均會影響CSN的脫Nedd活性及CUL3、CUL1、BTB蛋白的穩(wěn)定性[19-20]，而CSN5 JAMM結(jié)構(gòu)域的點突變株雖喪失脫Nedd活性，但CSN的組裝、CSN與Cullin蛋白的互作及SCFFWD-1復(fù)合物穩(wěn)定性均不受影響，說明對于維持CRLs的穩(wěn)定性而言，CSN的完整性比脫Nedd活性更重要。值得一提的是，CSN3的缺失會減少CSN復(fù)合物的數(shù)量并形成CSN4/5/6和CSN4/5/6/7等一些亞復(fù)合物[19-20]。

構(gòu)巢曲霉中任何CSN亞基的缺失均會導(dǎo)致脫Nedd活性喪失，其體內(nèi)7個亞基(CSN1-4, 6-8)的CSN復(fù)合物只有與CSN5整合后才具有脫Nedd活性，表明CSN5的融合是構(gòu)巢曲霉CSN組裝的最后一步，這與LID亞復(fù)合物的組裝順序有明顯區(qū)別[32-33]。

2.7 其他

PCI家族包括CSN、LID亞復(fù)合物、真核翻譯起始因子(EIF3)，它們共同調(diào)控從蛋白翻譯到蛋白降解的整個過程，三者間具有序列同源性、相似的結(jié)構(gòu)排布并且彼此互作[34]，相對于EIF3，CSN與LID的聯(lián)系更加緊密且具有極高的相似性，但也有明顯的區(qū)別及不同的組裝順序[35]。釀酒酵母中CSN11能與EIF3互作，CSN9 和CSI1能與LID中的RPN5互作[36]，除了三者間的互作，各CSN亞基會影響彼此的定位，野生型菌株中CSN5以復(fù)合物的形式聚集在細(xì)胞核，而CSN12缺失突變株中CSN5以單體形式存在，說明CSN12對于維持CSN的穩(wěn)定性非常重要，此外，CSN12、CSN10、PCI8/CSN11、CSI1均會影響CSN5在細(xì)胞內(nèi)的定位[36]。裂殖酵母中也有相似的結(jié)論，CSN4與CSN復(fù)合物的結(jié)合需要CSN1、CSN2和CSN5的協(xié)助，而任何一個CSN亞基的缺失都會影響到其余亞基特異性的核定位[14]。

許多真核生物中除CSN外，還有另外的脫Nedd酶DEN1，兩者間的明確分工還未徹底明確，構(gòu)巢曲霉中兩者參與不同的生活史，CSN主要調(diào)控有性生活史及次級代謝，而DEN1主要影響無性生活史[37]，兩者間的互作與平衡會影響細(xì)胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)定性、脫Nedd活性及發(fā)育中的光反應(yīng)等，CSN5/DEN1雙敲菌株結(jié)合了兩個單敲菌株的表型，即多細(xì)胞發(fā)育嚴(yán)重受損、主要進(jìn)行營養(yǎng)生長并產(chǎn)生紅色色素。此外，CSN3、CSN5、CSN6、CSN7和CSN8能調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)DEN1的穩(wěn)定性[37-38]。

3 小結(jié)與展望

本文對真菌中CSN的亞基組成及生物學(xué)功能進(jìn)行了總結(jié)，雖然有很多突出成果，但仍有很多問題亟待解決，未來可就以下幾個方面做進(jìn)一步研究：1)CSN與真菌致病性的關(guān)系。目前的研究多集中在模式真菌，CSN在其他病原真菌及真菌致病性方面的功能尚未研究，開展這方面的工作可為控制真菌病害提供新思路。2)CSN與生物工程。真菌發(fā)育與次級代謝密切相關(guān)，一些次級代謝基因簇在常規(guī)生長條件下保持沉默，而一些CSN突變菌株能將這些基因激活從而獲得新的次級代謝產(chǎn)物或增加已知的次級代謝物的產(chǎn)量，這可以為生物制藥、病害防治等提供新的思路[8, 39-40]。3)CSN與VEA、CAND1基因的確切關(guān)系。構(gòu)巢曲霉中，VEA、CAND1、CSN突變株間有相似的表型，這些基因間的確切關(guān)系有待深入研究[17, 41]。

此外，由于CSN的功能具有保守性，因此真菌中的很多研究成果，如CSN對生物鐘的調(diào)控、CSN對脂類代謝的調(diào)控、CSN與DEN1間的互作形式等，可以為其他真核生物中CSN的研究提供一定的參考。

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