江 蘭，王曉敏，唐思陽(yáng)，李月舟

(浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，杭州 310058)

21世紀(jì)，全球死亡人數(shù)的四分之一源于微生物感染，霍亂與結(jié)核被發(fā)現(xiàn)再次成為威脅人類生命健康的致命疾病[1]。人類面臨的一個(gè)主要醫(yī)療問題是細(xì)菌引起的某些重癥感染被發(fā)現(xiàn)已對(duì)常用抗生素產(chǎn)生了抗性[2]。青霉素廣泛使用后僅一年，相當(dāng)數(shù)量的金黃色葡萄球菌(Staphycococcusaureus,S.aureus)對(duì)青霉素形成了抗性；幾年后，超過50%的金黃色葡萄球菌不再對(duì)青霉素這種藥物敏感[3]。目前，每天都有越來越多的常見或罕見的細(xì)菌被報(bào)道對(duì)不同類型的抗生素形成耐藥性，抗生素的過量使用和病人未按醫(yī)囑完成完整的抗生素治療方案都在促使耐多藥細(xì)菌(multi-drug resistance, MDR)的出現(xiàn)[4]。耐藥菌如腸桿科細(xì)菌、結(jié)核桿菌、肺炎桿菌與淋球菌正嚴(yán)重威脅人類健康。但是由于財(cái)政、管理和科學(xué)等諸多障礙，新藥的研發(fā)進(jìn)程已減緩甚至停滯[5-6]。因此，治療病人的MDR細(xì)菌感染日益困難。目前，在抗生素的開發(fā)渠道研究中僅存在幾種相對(duì)較新的小分子[7]。MscL在細(xì)菌中普遍存在且氨基酸序列高度保守，此外，人類基因組不含MscL的基因。MscL被認(rèn)為是 20種最為頂尖的藥物靶標(biāo)之一[8]。因而，本文就MscL與抗生素的相互作用及其在藥物輸送過程中的潛在用途進(jìn)行綜述。

1 機(jī)械敏感通道

機(jī)械敏感通道(mechanosensitive channels, MS), 或稱“機(jī)械門控通道”，是一種跨膜通道蛋白，可以感受細(xì)胞膜表面的張力，將外界的物理刺激轉(zhuǎn)化為胞內(nèi)的生化信號(hào)，從而影響細(xì)胞的生命活動(dòng)[9-10]。

1.1 機(jī)械敏感通道的分布

MS通道最早在雞骨骼肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[11]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)物、植物與細(xì)菌中廣泛存在[12]。在哺乳動(dòng)物中，MS通道涉及眾多的生理功能，如細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞容積調(diào)節(jié)、血壓調(diào)控、聽力、觸覺、平衡和痛覺；許多疾病，如神經(jīng)與肌肉退變、動(dòng)脈硬化、高血壓、心律失常和青光眼等，都與MS通道異常有關(guān)[12-13]。

1.2 細(xì)菌上的機(jī)械敏感通道

目前，在大腸桿菌中已知有4種MS通道，根據(jù)電導(dǎo)將其分為MscM(mini, M)、MscS(small, S)、MscK(potassium, K)和MscL(large, L)[14]。迄今為止，研究最為透徹的是大電導(dǎo)機(jī)械敏感通道MscL。大腸桿菌MscL由5個(gè)相同的亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基含有136個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為17 ku，其大部分氨基酸為非極性氨基酸，不含半胱氨酸(Cys)；每個(gè)MscL亞基含有兩個(gè)跨膜區(qū)域( transmembrane1, TM1與 transmembrane 2, TM2), 一個(gè)細(xì)胞外Loop區(qū)域和位于細(xì)胞內(nèi)的N端與C端[15]。研究表明TM1形成MscL的孔道，TM2位于孔道外側(cè)并和膜脂質(zhì)作用； MscL直接感知細(xì)胞膜上的張力而開放，并介導(dǎo)離子、小分子、甚至小的蛋白質(zhì)通過細(xì)胞；MscL不具備離子選擇性，溶質(zhì)的分子直徑為其唯一的選擇依據(jù)[16]。

在革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌與古細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)MscL的存在，而且細(xì)菌MscL的氨基酸序列具有很高的保守性，TM1和TM2中部分氨基酸位點(diǎn)的保守性可高達(dá)90%和80%[17-18]。但在哺乳動(dòng)物和人類基因組中并沒有發(fā)現(xiàn)有MscL的同源體。MscL最早在大腸桿菌(E.coli)中發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌的滲透調(diào)節(jié)過程中，MscL作為 “緊急釋放閥”而起作用：在細(xì)菌的外部環(huán)境的滲透壓急劇下降時(shí)，首先，水開始進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞引起細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜上產(chǎn)生張力；然后，細(xì)胞膜上的MscL直接感知張力而開放并且形成一個(gè)直徑約為30 ?的通道，釋放胞內(nèi)物質(zhì)，維持滲透壓的平衡，從而避免細(xì)胞的裂解[19]。MscL敲除的大腸桿菌對(duì)低滲沖擊特別敏感，而表達(dá)MscL后，其低滲致死的表型可以被恢復(fù)正常[20]。MscL對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)也有非常重要的作用，MscL功能異常的突變體會(huì)釋放細(xì)胞內(nèi)容物導(dǎo)致細(xì)菌的生長(zhǎng)緩慢甚至引起細(xì)菌死亡。因此，必須嚴(yán)格調(diào)節(jié)與控制MscL的開放。

結(jié)構(gòu)和功能的研究顯示MscL是5個(gè)TM1緊密捆綁構(gòu)成一個(gè)漏斗狀結(jié)構(gòu)的通道，在胞質(zhì)側(cè)形成一個(gè)疏水的限制性位點(diǎn)，此位點(diǎn)的通道直徑約2?，為整個(gè)通道最窄的位置。限制性位點(diǎn)作為通道的閘門而發(fā)揮作用，因此，在MscL的開放過程中，疏水閘門的直徑范圍約為2?～30?[21]，小分子藥物可憑借MscL進(jìn)入細(xì)菌，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)；并且，MscL純化重組于人工膜仍然能夠保持原有的活性與功能[22]。因此，對(duì)于藥物而言，MscL是一個(gè)非常好的靶標(biāo)。

2 MscL與抗生素的相互作用

2.1 MscL增強(qiáng)鏈霉素的藥效

鏈霉素是人類發(fā)現(xiàn)的第一種氨基糖苷類抗生素，產(chǎn)生于放線菌屬中的鏈霉菌。自1944年發(fā)現(xiàn)以來，其作用機(jī)制得到了廣泛的研究。它的主要作用機(jī)制為：首先，鏈霉素進(jìn)入細(xì)胞；然后，它與核糖體30S亞基的S12蛋白結(jié)合并抑制翻譯，并且可能引起mRNA誤讀[23]。鏈霉素廣泛用于治療由革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏陰性菌引起的細(xì)菌感染疾病，如結(jié)核病、心內(nèi)膜感染、腦膜感染和瘟疫[24-25]。

但是，體積大且?guī)щ姾傻逆溍顾剡M(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部的機(jī)制在很大程度上是未知的。直到最近，有研究報(bào)道MscL通道的表達(dá)極大程度地增加了鏈霉素與二氫鏈霉素的效力，然而在MscS通道表達(dá)時(shí)沒有觀察到效力差異，這似乎表明鏈霉素特異性地直接激活通道MscL[26]。目前，有研究人員發(fā)現(xiàn)了鏈霉素進(jìn)入細(xì)胞的一種新機(jī)制：二氫鏈霉素與MscL的特定部位(如E.coliMscL 第19位亮氨酸L19)直接結(jié)合并修飾MscL通道構(gòu)象，MscL通道被激活和打開，胞內(nèi)的K+外流，導(dǎo)致細(xì)胞膜電位超極化；超極化加大了細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度，使胞外的帶正電的鏈霉素更容易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，從而增強(qiáng)鏈霉素的藥效[27]。

數(shù)據(jù)表明，直徑小于30?的化合物則可以通過MscL[28]。而鏈霉素的直徑約為10?，因此，通道MscL可以介導(dǎo)鏈霉素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，從而殺滅細(xì)菌。因此，MscL可能是鏈霉素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的一種新途徑。此外，在未表達(dá)MscL的菌株中，鏈霉素仍有藥效(但此時(shí)需要更高濃度的鏈霉素)[26]。這表明，鏈霉素還可以憑借MscL外的其他途徑進(jìn)入細(xì)胞。MscL不但可以增強(qiáng)鏈霉素的藥效，還可以增強(qiáng)其他一些藥物的藥效。如奇霉素、紫霉素、硝呋奇特等抗生素在MscL表達(dá)的菌株藥效能得到極大增強(qiáng)[26]。

綜合結(jié)果表明，MscL可以增強(qiáng)抗生素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的效率，從而增強(qiáng)抗生素的藥效。這表明可以將MscL作為抗生素研究的靶標(biāo)。

2.2 MscL協(xié)助治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染

金黃色葡萄球菌是造成傷口化膿的主要原因，它主要感染皮膚與軟組織等，它是威脅人類健康的主要致病菌之一[29]。1959年，甲氧西林開始用于治療耐青霉素S.aureus引起的感染；1961年開始，英國(guó)首先發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantS.aureus, MRSA)；迅速地，其他歐洲國(guó)家、日本、澳大利亞和美國(guó)也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)MRSA[30]。由于新型抗生素研制的緩慢，使得“超級(jí)細(xì)菌” MRSA的治療越來越難。為了解決這個(gè)問題，澳大利亞和美國(guó)的研究人員以MscL為靶標(biāo)設(shè)計(jì)了一類新型抗生素10(1,3,5-tris[(1E)-2′-(4″-benzoic acid)vinyl] benzene )[31]。研究顯示，抗生素10是一種有效的抗生素，可治愈感染MRSA的秀麗隱桿線蟲。目前，許多MRSA引起的感染使用糖肽類抗生素治療，如萬古霉素[32-33]。按照FDA的標(biāo)準(zhǔn)，治療MRSA感染，萬古霉素的治療濃度范圍為20～40 μg/mL。然而，僅約1.5 μg/mL的抗生素10，即可有效治療MRSA感染。

研究顯示，抗生素10對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有很強(qiáng)的藥效，但對(duì)革蘭氏陰性菌的作用較小[34]；抗生素10對(duì)陰性菌的藥效較弱，可能是由于革蘭氏陰性菌含有脂多糖外膜保護(hù)細(xì)菌。盡管抗生素10對(duì)MRSA感染的治療十分有效，但是它在治療濃度下在人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中均沒有顯示細(xì)胞毒性[35-36]。因此，以MscL為靶標(biāo)的抗生素10是一種極具潛力的抗菌試劑。這也表明將MscL作為靶標(biāo)來研發(fā)新藥以治療耐藥菌感染是一個(gè)很好的研究方向。

3 MscL的潛在用途

MscL能夠在體外表達(dá)，并且當(dāng)MscL純化重組于脂質(zhì)雙分子層后仍具有機(jī)械敏感性；MscL的激活不需要其他蛋白等輔助成分，完全依賴于脂質(zhì)雙分子層，脂質(zhì)雙分子層的厚度、膜的剛度與脂質(zhì)單分子層的自發(fā)曲率都會(huì)影響MscL的機(jī)械敏感性[22, 37]。此外，MscL具有極大的開放孔徑和廣泛的物質(zhì)通透性。MscL的這些特征，促使它在藥物的攝入與釋放應(yīng)用研究中十分具有吸引力。

3.1 MscL可介導(dǎo)藥物進(jìn)入細(xì)胞

目前，不能透過細(xì)胞膜的生物大分子主要依靠細(xì)胞穿透肽(cell-penetrating peptides, CPPs)介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，CPPs已經(jīng)成為大分子跨越細(xì)胞膜的有效工具，但是生物分子必須與CPPs有關(guān)聯(lián)才可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞[38]。因此，對(duì)于沒有關(guān)聯(lián)CPPs但又需要進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮其作用的生物活性分子，必須尋找其他途徑。

例如，生物活性分子——鬼筆環(huán)肽，它不易透過細(xì)胞膜，但是它是微絲的特異性標(biāo)志物，因此在微絲的相關(guān)研究中需采取特殊的理化處理，鬼筆環(huán)肽才可透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，這給研究工作帶來不便[39]。MscL雖然只存在于細(xì)菌，但是MscL可以人工重構(gòu)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且其仍然具有完好的生理功能[40]。因此，有研究人員將MscL在體外表達(dá)，并將其重構(gòu)于哺乳細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)一些重要的生物活性分子如鬼筆環(huán)肽、聚賴氨酸肽、乳鐵蛋白衍生肽等不能透過細(xì)胞膜的大分子通過MscL進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞[41-42]。

因此，MscL可介導(dǎo)不能透過細(xì)胞膜的生物活性分子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，表明MscL可作為轉(zhuǎn)運(yùn)工具將多肽或者藥物分子轉(zhuǎn)入細(xì)胞，這為藥物的攝取提供了新的研究方向。

3.2 MscL可調(diào)控藥物釋放

大腸桿菌MscL作為大電導(dǎo)的機(jī)械敏感離子通道，是目前研究最為清楚的通道蛋白之一。MscL通道的開放需要克服極大的能量障礙，因此，在正常的情況下MscL通道是關(guān)閉的；但是，當(dāng)細(xì)胞膜上的壓力達(dá)到閾值時(shí)，MscL通道的構(gòu)象將發(fā)生變化，由閉合轉(zhuǎn)為開放[43]。

通常情況下，MscL的開放是來源于膜上的壓力刺激。然而，引進(jìn)極性或者帶電氨基酸，以及其他帶電化合物到E.coliMscL的第22位氨基酸或者第26位氨基酸的位置同樣會(huì)引起MscL的自發(fā)開放[44-45]。研究顯示，MscL的兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)G22或者G26突變?yōu)榘腚装彼?，然后用人工合成的光敏感化合物修飾G22C或者G26C，用波長(zhǎng)為366 nm的紫外光照射MscL通道，光敏感化合物將會(huì)發(fā)生電荷分離，引起與化合物連接的MscL通道打開；然后再用可見光照射MscL通道，通道則回到關(guān)閉狀態(tài)[46-47]。在光照條件下，修飾后的MscL的開放或者關(guān)閉是可調(diào)控的。

因此，MscL作為一個(gè)在光照下可自由開放與關(guān)閉的納米閥門，為今后研究調(diào)控藥物的釋放提供了一個(gè)新的研究方向。

4 總結(jié)與展望

數(shù)據(jù)顯示，細(xì)菌耐藥性問題已經(jīng)成為一個(gè)全球問題，革蘭氏陽(yáng)性菌，特別是金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、糞腸球菌和肺炎鏈球菌的耐藥性問題對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[48]。盡管耐藥菌日漸增多，但是新藥的研發(fā)進(jìn)程卻十分緩慢[49]，因此，人類急需尋找能有效抑菌的藥物或者治療方案。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，MscL通道具有在細(xì)菌中普遍分布和在不同細(xì)菌中有很強(qiáng)的序列保守性等多方面的特點(diǎn)，使得MscL靶標(biāo)在治療細(xì)菌感染有很好的前景[47-50]。近年來，關(guān)于MscL的研究逐漸增多，研究人員開始注意MscL在治療耐藥菌方面的應(yīng)用，研究主要集中于E.coliMscL，但是并沒有E.coliMscL的晶體結(jié)構(gòu)。這需要盡快獲得E.coliMscL的晶體，將理論知識(shí)與晶體結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)，考慮設(shè)計(jì)藥效更強(qiáng)的藥物分子。目前，其他細(xì)菌中的MscL的研究仍然較少，因此，也需要加大在其他種類細(xì)菌中的MscL研究，積累更多的理論依據(jù)，確定不同細(xì)菌中的MscL與抗生素作用的機(jī)制，在理論指導(dǎo)下篩選或者設(shè)計(jì)有效的藥物分子。

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