李宜川 劉國玲 蘆琨 常景芝 劉青 郭婭麗

【摘 要】目的：觀察川芎嗪（TMP）對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠滑膜組織細(xì)胞的增殖、凋亡及滑膜組織中p53表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制。方法：將50只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只和模型組40只。模型組采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)大鼠CIA模型，36只大鼠造模成功。將造模成功的36只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、地塞米松組、TMP高劑量組和TMP低劑量組，每組9只。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予2 mL·kg-1生理鹽水肌肉注射，地塞米松組給予地塞米松2 mg·kg-1肌肉注射，TMP高劑量組肌肉給藥TMP 100 mg·kg-1，TMP低劑量組肌肉給藥TMP 50 mg·kg-1。觀察

CIA大鼠足腫脹度與關(guān)節(jié)炎指數(shù)，MTT法檢測(cè)TMP對(duì)CIA大鼠足關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖的影響，堿性磷酸酶標(biāo)記法檢測(cè)CIA大鼠足關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡，免疫組化法檢測(cè)CIA大鼠足關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞p53表達(dá)。結(jié)果：TMP高劑量組大鼠足爪腫脹程度峰值降低，關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降（P < 0.01）；TMP（100 mg·kg-1）可抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖，增高大鼠滑膜細(xì)胞凋亡積分（P < 0.01），明顯降低p53表達(dá)（P < 0.01）。結(jié)論：TMP（100 mg·kg-1）可抑制CIA大鼠的足爪腫脹和多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，對(duì)CIA大鼠具有明顯的治療作用；其機(jī)制可能是通過降低CIA大鼠滑膜細(xì)胞p53的異常表達(dá)水平，促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡，抑制關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖，減輕局部慢性炎癥反應(yīng)，從而對(duì)CIA大鼠發(fā)揮治療作用。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；膠原誘導(dǎo)性；川芎嗪；滑膜細(xì)胞；增殖；凋亡；p53；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of tetramethylpyrazine（TMP）on the proliferation，apoptosis of synovial cells and the expression of p53 in synovial tissue of rats with collagen induced arthritis and further explore its possible mechanism in the treatment of rheumatoid arthritis.Methods：Fifty SD rats were randomly divided into a normal control group（10 rats）and a model group（40 rats）.The model group was induced by type Ⅱ collagen to establish 36 CAI rat models which then were randomly divided into a model control group，a dexamethasone group，a high-dose TMP group and a low-dose TMP group，with 9 rats in each.The normal control group and the model control group were given an intramuscular injection of 2 mL·kg-1 of physiological saline.The dexamethasone group was given an intramuscular injection of 2 mg·kg-1 of dexamethasone.The high-dose TMP group and the low-dose TMP group were medicated to muscles respectively 100 mg·kg-1 and 50 mg·kg-1of TMP.The foot swelling and arthritis index of the CIA rats were observed.MTT method was used to detect the influence of TMP on the proliferation of synovial cells of CIA foot joints.Alkaline phosphatase labeling was used to detect the apoptosis of synovial cells in the foot joints of CIA rats.The immunohistochemistry method was used to detect the expression of p53 in the synovial cells in foot joints of CIA rats.Results：The paw swelling peak and arthritis index decreased in the high-dose TMP group（P < 0.01）；TMP（100 mg·kg-1）could inhibit the proliferation of synovial cells in CIA rats，increase apoptosis integral of synovial cells（P < 0.01），and significantly reduce the expression of p53（P < 0.01）.Conclusion：TMP（100 mg·kg-1）can inhibit the paw swelling of CIA rats and polyarthritis and has an obvious therapeutic effect on CIA rats，whose treating mechanism may be through reducing the abnormal expression of p53 in synovial cells of CIA rats，promoting apoptosis of synovial cells，inhibiting synovial cell proliferation and reducing the local chronic inflammation reaction.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；collagen inducibility；tetramethylpyrazine；synovial cells；proliferation；apoptosis；p53；rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumation arthritis，RA）是以晨僵、關(guān)節(jié)腫痛、活動(dòng)受限為主要臨床表現(xiàn)，以關(guān)節(jié)滑膜為靶器官的自身免疫性疾病，以慢性滑膜炎、滑膜細(xì)胞增生、骨質(zhì)與軟骨破壞為主要病理特征，最終導(dǎo)致受累關(guān)節(jié)發(fā)生畸形而出現(xiàn)關(guān)節(jié)廢用、致殘，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。RA的發(fā)病與細(xì)胞因子、遺傳、感染等多種因素有關(guān)[1]，由于其發(fā)病機(jī)制還不完全明確，對(duì)其防治就顯得十分艱難。早期的非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素以及各種新型抗RA藥物都存在著諸多不良反應(yīng)，使患者難以接受。川芎嗪（TMP）是從川芎的生物堿中分離得到的有效單體，具有活血行氣、抑制血小板聚集、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、抑制RA炎癥因子分泌、防止自身抗體的大量產(chǎn)生和抗腫瘤等作用[2-3]。張利省等[4-5]將TMP用于治療RA，效果顯著。但其作用機(jī)制尚未明確報(bào)道。有研究報(bào)道，RA關(guān)節(jié)滑膜組織增生的原因與滑膜細(xì)胞凋亡機(jī)制障礙引起滑膜細(xì)胞增殖和凋亡之間的失衡有關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)在成功建立大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型的基礎(chǔ)上，通過觀察CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的變化，檢測(cè)CIA大鼠足關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖、凋亡和滑膜組織中p53的表達(dá)，探討TMP治療RA可能的作用途徑，為TMP的進(jìn)一步開發(fā)、利用及更有效的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠50只，清潔Ⅱ級(jí)，鼠齡3個(gè)月，雌雄各半，體質(zhì)量160～180 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（晉）20150001。大鼠分籠飼養(yǎng)，專人管理，自由攝食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～24℃，相對(duì)濕度為40%～60%。

1.2 試 劑 磷酸川芎嗪片（無錫市第七制藥廠）；弗氏完全佐劑、雞Ⅱ型膠原（上海本草生物醫(yī)學(xué)工程所）；胎牛血清（FBS）、胰酶（EDTA）、DMEM培養(yǎng)基、PBS（Sigma公司）；MTT、二甲基亞砜（DMSO）（Gibco公司）。

1.3 儀 器 WD-9409型超凈工作臺(tái)（北京六一儀器廠）；80-2型離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司提供）；EL30型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）。

2 方 法

2.1 CIA大鼠模型的制備及用藥 實(shí)驗(yàn)用大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只和模型組40只。模型組采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)CIA大鼠模型，方法為將雞CⅡ和等體積弗氏完全佐劑混合充分乳化后，制成膠原質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 mg·mL-1的CⅡ乳劑，將混懸乳劑1 mL在大鼠的左后肢足跖皮內(nèi)皮下給予致炎，7 d后在大鼠尾、背6～8個(gè)部位皮下給予0.1 mL該膠原乳劑作為加強(qiáng)免疫，共36只大鼠造模成功。正常對(duì)照組等容量相同部位注射0.1 mL生理鹽水。將36只造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組、地塞米松組、TMP高劑量組和TMP低劑量組，每組 9只。于造模后第7天至第35天每日給藥1次，地塞米松組給予地塞米松注射液2 mg·kg-1肌肉注射，TMP高劑量組肌肉給藥TMP 100 mg·kg-1，TMP低劑量組肌肉給藥TMP 50 mg·kg-1[7]，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予2 mL·kg-1生理鹽水肌肉注射。

2.2 CIA大鼠足腫脹度測(cè)量 用足容積測(cè)定儀分別于給藥前及給藥后第7，14，18，22，26，30天測(cè)左足體積，計(jì)算足腫脹度，公式 =（給藥后值-給藥前值）/給藥前值×100%。

2.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化 從致炎后第7天起開始觀察記錄，第14天起各組每隔4天進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分[8]。

2.4 TMP對(duì)細(xì)胞增殖的影響 造膜35 d后處死大鼠，無菌情況下取下滑膜組織，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的Ⅱ型膠原酶消化液加入含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)消化，傳代培養(yǎng)[9]。MTT法檢測(cè)TMP對(duì)細(xì)胞增殖的影響：將對(duì)數(shù)生長期的滑膜細(xì)胞以1×105·mL-1的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，孵育24 h，待細(xì)胞貼壁后，分別在各個(gè)培養(yǎng)孔中加入不同濃度的TMP 10 μL，以及含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS的DMEM培養(yǎng)液90 μL，使各孔的溶液體積為200 μL。繼續(xù)孵育48 h后，加入四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）溶液（5 mg·mL-1）20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，搖床低速振蕩10 min，用酶標(biāo)檢測(cè)儀于490 nm波長處測(cè)吸光度OD值（A值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，記錄結(jié)果。

2.5 滑膜細(xì)胞凋亡檢測(cè) 按照試劑盒操作步驟進(jìn)行堿性磷酸酶標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，檢測(cè)結(jié)果判斷：在滑膜組織中，細(xì)胞皺縮，凋亡細(xì)胞核呈深藍(lán)色或青紫色，凋亡細(xì)胞周圍無炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，每張切片選取5～10個(gè)視野，沿滑膜組織帶計(jì)算400倍視野中細(xì)胞的凋亡數(shù)，標(biāo)出每個(gè)視野平均細(xì)胞凋亡數(shù)[10]。

2.6 p53表達(dá)檢測(cè) 按照試劑盒操作步驟進(jìn)行免疫組化法p53蛋白表達(dá)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果判斷：p53蛋白表達(dá)陽性的滑膜組織細(xì)胞核呈橘黃色或棕褐色，每張切片沿滑膜組織帶計(jì)算400倍視野中陽性細(xì)胞的占有率，計(jì)數(shù)3個(gè)視野，標(biāo)出每個(gè)視野平均陽性細(xì)胞占有率，并按陽性細(xì)胞占有率分為5級(jí)。0，無陽性細(xì)胞；+，陽性細(xì)胞率0%～25%；++，陽性細(xì)胞率 > 25%～50%；+++，陽性細(xì)胞率 > 50%～75%；++++，陽性細(xì)胞率 > 75%～100%。0級(jí)定級(jí)積分為0，+積分為1，以此類推[10]。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 TMP對(duì)CIA大鼠足爪腫脹度的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組足爪腫脹度明顯增加（P < 0.01）；與模型對(duì)照組比較，治療18 d后，TMP高劑量組及地塞米松組比模型對(duì)照組大鼠足爪腫脹度峰值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；

TMP低劑量組與模型組大鼠足爪腫脹度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

3.2 TMP對(duì)CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 與正常對(duì)照組比較，致炎后第14天開始，模型對(duì)照組多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.01）；治療18 d后，TMP高劑量組及地塞米松組比模型對(duì)照組多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；TMP低劑量組與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

3.3 TMP對(duì)CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖的影響 MTT法研究顯示，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠滑膜組織增殖明顯升高（P < 0.01）；與模型對(duì)照組比較，地塞米松組與TMP高劑量組可降低OD值，提高抑制率（P < 0.01）；TMP低劑量組與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

3.4 TMP對(duì)CIA大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡及p53的影響 堿性磷酸酶標(biāo)記法和免疫組化法鏡下觀察滑膜細(xì)胞凋亡與p53表達(dá)積分顯示：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡積分明顯下降、p53表達(dá)明顯增高（P < 0.01）；與模型組比較，TMP高劑量組與地塞米松組大鼠滑膜細(xì)胞凋亡積分增高、p53表達(dá)下降（P < 0.01）；TMP低劑量組與模型對(duì)照組比較，滑膜細(xì)胞凋亡積分、p53表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表4。

4 討 論

RA的病因及發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，但越來越多的證據(jù)表明破骨細(xì)胞的過度增殖、滑膜細(xì)胞凋亡障礙等在其發(fā)病中起著決定性的作用。RA關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的損害主要是由于滑膜細(xì)胞的活化和增生引起?；ぜ?xì)胞過度增生源于滑膜細(xì)胞凋亡的相對(duì)不足，RA患者滑膜細(xì)胞存在細(xì)胞凋亡過程的異常，這些異?？赡芘cp53表達(dá)失衡及體內(nèi)其他調(diào)節(jié)因素（如炎性細(xì)胞因子等）有關(guān)[11]。

FIRESTEIN等[12]發(fā)現(xiàn)，與腫瘤組織相似的p53異常表達(dá)在RA軟骨侵蝕處的滑膜和培養(yǎng)的RA滑膜細(xì)胞存在。p53是一種抑制癌蛋白，它還可提供限制細(xì)胞生長和導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)，是DNA修復(fù)和細(xì)胞復(fù)制的重要調(diào)節(jié)因子[13]。p53通過增加表達(dá)修復(fù)損傷的DNA，如損傷嚴(yán)重不能修復(fù)，則細(xì)胞凋亡，當(dāng)p53發(fā)生異常表達(dá)時(shí)細(xì)胞凋亡受阻，導(dǎo)致細(xì)胞過度增生[14]；p53異常表達(dá)可能與RA滑膜組織慢性炎癥致DNA損傷有關(guān)[15]；在RA病程中，p53異常表達(dá)可降低細(xì)胞凋亡的能力，促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖，致關(guān)節(jié)損害[16]。AUPPERLE等[17]研究也表明，RA滑膜細(xì)胞p53蛋白存在異常表達(dá)，并證實(shí)p53蛋白是滑膜細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)劑。因此，抑制滑膜細(xì)胞過度增生、促進(jìn)其凋亡，有可能成為治療這類疾病的一個(gè)有效途徑。

TMP是中藥川芎的有效成分之一，具有活血化瘀、理氣、抗炎、止痛、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)等作用，但其治療RA的具體作用機(jī)制尚不十分明確。本研究結(jié)果顯示，TMP（100 mg·kg-1）可明顯降低足爪腫脹程度峰值，使關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降（P < 0.01），對(duì)CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎有明顯療效；與模型對(duì)照組比較，TMP（100 mg·kg-1）可降低OD值、提高抑制率。堿性磷酸酶標(biāo)記法和免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，TMP（100 mg·kg-1）可明顯增高細(xì)胞凋亡積分、下調(diào)p53表達(dá)，說明TMP

（100 mg·kg-1）對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的治療作用可能與下調(diào)p53表達(dá)從而促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞是TMP發(fā)揮作用的主要靶細(xì)胞之一，對(duì)CIA大鼠具有明顯的治療作用，其機(jī)制可能是通過降低CIA大鼠滑膜細(xì)胞p53的表達(dá)水平，促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡，抑制關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞增殖，減輕局部慢性炎癥反應(yīng)，從而對(duì)CIA大鼠發(fā)揮治療作用。

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