何佳男,羅文娜,劉曉春，林浩然

(有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室∥中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是一系列位于染色體上與免疫功能密切相關(guān)的基因家族，具有高度多態(tài)性，編碼產(chǎn)物是免疫系統(tǒng)中極為復(fù)雜的細(xì)胞表面膜蛋白。MHC編碼的糖蛋白廣泛分布于細(xì)胞表面，參與抗原遞呈，直接參與病原入侵機(jī)體后的免疫應(yīng)答和調(diào)控，維持機(jī)體自身的功能。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，MHC基因編碼的蛋白產(chǎn)物可以分為兩類：MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子，哺乳動(dòng)物中還存在MHCⅢ類分子。魚(yú)類MHCⅠ類MHCⅡ類均與哺乳動(dòng)物相似，都是由α鏈和β鏈組成的異二聚體。MHCⅠ類分子是由MHCⅠ類基因編碼的重鏈(α鏈)和非MHCⅠ類基因編碼，由位于不同染色體的β2微球蛋白基因編碼的輕鏈(β鏈)以非共價(jià)鍵形成的二聚體，主要參與內(nèi)源性抗原加工遞呈途徑。而MHCⅡ類分子的重鏈(α鏈)和輕鏈(β鏈)都是由MHCⅡ類基因編碼，主要參與外源性抗原遞呈[1]。

自1990年人們克隆出鯉魚(yú)[2]的MHC基因部分序列以來(lái)，目前已對(duì)多種魚(yú)類的MHC基因進(jìn)行了研究[3-13]。越來(lái)越多的研究表明，MHC基因的多態(tài)性和物種對(duì)疾病的抗性或易感具有相關(guān)性[14-22]。在牙鲆經(jīng)過(guò)鰻弧菌攻毒后進(jìn)行MHCⅡβ基因多態(tài)性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)等位基因g和h只出現(xiàn)在抗病個(gè)體中，而等位基因l只出現(xiàn)在感病群體中[23]。在鯉魚(yú)中，病毒感染后，Cyca-DAB1-like的等位基因E表現(xiàn)出更高的抗病性，等位基因B、H、J表現(xiàn)出更容易被病毒所感染[24]。在三刺魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn)，MHCⅡβ基因型多的家族對(duì)寄生蟲(chóng)的抗病性更強(qiáng)[25]。這些研究結(jié)果說(shuō)明了MHC作為候選抗病基因的合理性，為篩選抗病基因進(jìn)行魚(yú)類抗病育種奠定了基礎(chǔ)。

尼羅羅非魚(yú)Oreochromisniloticus隸屬于硬骨魚(yú)綱Osteichthyes、鱸形目Perciformes、鱸形亞目Percoidei、麗魚(yú)科Cichlidae。具有生長(zhǎng)速度，產(chǎn)量高，食性雜，需氧低，適應(yīng)能力高，繁殖快，肉質(zhì)好等特點(diǎn)。目前羅非魚(yú)養(yǎng)殖在世界各國(guó)都有，已經(jīng)成為全球主要養(yǎng)殖品種之一，而中國(guó)是世界上最大的羅非魚(yú)養(yǎng)殖國(guó)家。近年來(lái)，羅非魚(yú)鏈球菌病的暴發(fā)已成為制約羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。2009年，廣東、福建、廣西、海南等我們南方羅非魚(yú)養(yǎng)殖的主要地區(qū)都受到了鏈球菌病的困擾，發(fā)病率在20%以上，死亡率達(dá)80%以上[26]。因此開(kāi)展羅非魚(yú)抗病相關(guān)基因的研究對(duì)于羅非魚(yú)病害防治、抗病選育具有潛在的重要意義。

本研究對(duì)尼羅羅非魚(yú)的MHCⅡβ基因進(jìn)行了基因序列克隆，通過(guò)MHCⅡβ基因編碼的氨基酸序列構(gòu)建了尼羅羅非魚(yú)、人、鼠和其他魚(yú)類的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，并分析了MHCⅡβ基因在正常的羅非魚(yú)組織表達(dá)模式，以及在被海豚鏈球菌感染后MHCⅡβ基因在頭腎中表達(dá)量的變化情況。同時(shí)，我們還通過(guò)克隆開(kāi)放讀碼框初步分析了MHCⅡβ基因的多態(tài)性，并通過(guò)PCR-SSCP技術(shù)初步分析了在細(xì)菌感染后在易感個(gè)體和抗病個(gè)體中MHCⅡβ基因的第2外顯子的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了羅非魚(yú)至少存在的MHCⅡβ基因型和基因座的數(shù)量，為進(jìn)一步探討基因型多態(tài)性和抗病相關(guān)關(guān)系分析打下了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為尼羅羅非魚(yú)Oreochromisniloticus，體長(zhǎng)約20 cm，取自廣東省羅非魚(yú)良種場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1 周，確定健康無(wú)病后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。取樣時(shí)，冰上麻醉羅非魚(yú)，取垂體、腦、鰓、心臟、脾臟、胃、腎臟、肌肉、皮膚、腸、肝臟、胸腺、頭腎等組織放于液氮速凍，至于-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于MHCⅡβ基因組織分布研究。取樣用的所有解剖器械和玻璃器皿均經(jīng)180 ℃烘烤3 h，存放樣品的1.5 mL進(jìn)口離心管，滅活RNA酶。另取300條體長(zhǎng)約為12 cm的尼羅羅非魚(yú)用于海豚鏈球菌Streptococcusiniae感染實(shí)驗(yàn)。

1.2　細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)

海豚鏈球菌StreptococcusiniaeTBY-1由中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所李安興教授實(shí)驗(yàn)室保種。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定正式實(shí)驗(yàn)的攻毒濃度為4.8×108cfu/mL。將300尾實(shí)驗(yàn)用魚(yú)隨機(jī)分為10個(gè)組，其中對(duì)照組2個(gè)，實(shí)驗(yàn)組8個(gè)，實(shí)驗(yàn)組每尾魚(yú)腹腔注射100 μL菌液，對(duì)照組注射等體積的PBS。攻毒實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的0，6，12，24，48，72，96和120 h取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組魚(yú)的頭腎樣品，對(duì)照組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取6尾，共計(jì)48尾，實(shí)驗(yàn)組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取7尾，共計(jì)49尾，用于MHCⅡβ基因表達(dá)變化研究。攻毒后取抗病個(gè)體和易感個(gè)體的尾鰭組織保存于酒精中備用。

1.3　DNA和總RNA的提取及cDNA模板的制備

魚(yú)鰭DNA提取參照TIANGEN公司海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書，w=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。各組織總RNA提取方法參照Trizol?reagent (Invitrogen，USA)說(shuō)明書，w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。取1 μg總RNA樣品，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace-α-TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA，用于表達(dá)模式分析或5′- RACE和3′- RACE，AP (所有引物見(jiàn)表1)用于5′-RACE和3′-RACE，Oligo(dT) 用于表達(dá)模式分析，PCR反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃ 20 min；99 ℃ 5 min；4 ℃ 5 min。

表1　MHC基因克隆和Real-time PCR反應(yīng)引物組合Table 1　Primer pairs of combination used in cloning andReal-time PCR

1.4　羅非魚(yú)MHC Ⅱ β cDNA全長(zhǎng)及基因組序列擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，根據(jù)基因庫(kù)中其他魚(yú)類的MHCⅡβ的相對(duì)保守序列，設(shè)計(jì)引物MHCⅡβ-partial-F和MHCⅡβ-partial-R擴(kuò)增中間片段。反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min(39cycles)；72 ℃，10 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存。根據(jù)已獲得的cDNA中間序列，分別設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增3′端和 5′端的巢式引物。

以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，采用3′端特異性引物MHCⅡβ-race-F1和AUAP為接頭引物進(jìn)行第一輪PCR，一輪產(chǎn)物稀釋10～100倍，采用嵌套引物MHCⅡβ-race-F2，MHCⅡβ-race-F3和AUAP進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，1 min(39cycles)；72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物4℃保存。

以5′-RACE反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，采用5′端特異性引物MHCⅡβ-race-R1和AAP為接頭引物進(jìn)行第一輪PCR，將一輪產(chǎn)物稀釋10～100倍，采用嵌套引物MHCⅡβ-race-R2、MHCⅡβ-race-R3和AUAP進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。反應(yīng)條件與3′端相同。

將中間片段、3′-RACE、5′-RACE序列片段進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接獲得的羅非魚(yú)MHCⅡβ基因cDNA序列，在其序列兩端非編碼區(qū)選取保守片斷設(shè)計(jì)特異引物MHCⅡβ-full-F和MHCⅡβ-Intron3，4-R進(jìn)行ORF驗(yàn)證，檢驗(yàn)拼接所得cDNA全長(zhǎng)序列。獲得cDNA全長(zhǎng)后通過(guò)和其他脊椎動(dòng)物的MHCⅡβ基因組序列比對(duì)，利用3組特異性引物對(duì)MHCⅡβ-Intron1-F和MHCⅡβ-Intron1-R、MHCⅡ β-Intron2-F和MHCⅡβ- partial -R、MHCⅡβ-Intron3，4-F和MHCⅡβ-Intron3，4-R，分別從同一個(gè)羅非魚(yú)個(gè)體的基因組中進(jìn)行內(nèi)含子的PCR擴(kuò)增。

1.5　序列分析與進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

開(kāi)放讀碼框由DNAtools 6.0軟件預(yù)測(cè)并翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列；核苷酸同源性比對(duì)由NCBI(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上的BLAST程序完成；蛋白序列的多重比對(duì)使用Clustal X 1.8軟件；進(jìn)化樹(shù)由Mega 4.0 軟件構(gòu)建完成；利用http：∥www.expasy.ch/cgi-bin/pi_tool對(duì)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)及相對(duì)分子質(zhì)量等信息進(jìn)行分析；利用http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/對(duì)跨膜區(qū)分析，利用SignalP 3.0(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，利用SMART(http：∥smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。

1.6　MHC Ⅱβ基因的組織分布及感染后表達(dá)量的變化

Real-time PCR用到特異性引物見(jiàn)表1中的MHCⅡβ-Intron3，4-F和MHCⅡβ-Intron3，4-R，以18 s作為內(nèi)參，參照SYBR?Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO， Japan)試劑盒說(shuō)明書。反應(yīng)程序?yàn)椋菏紫?5 ℃預(yù)變性60 s，然后 95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸25 s，共40個(gè)循環(huán)。最后進(jìn)行溶解曲線分析，以確定PCR產(chǎn)物質(zhì)量。熒光定量PCR結(jié)束后，讀取標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的CT 值，并由系統(tǒng)給出標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，將羅非魚(yú)不同組織中MHCⅡβ基因的表達(dá)量和18 S基因的表達(dá)量所對(duì)應(yīng)的CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比照，即可得到該樣品所測(cè)基因表達(dá)量的相對(duì)濃度值。所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±S.E.M.)來(lái)表示。采用SPSS 13.0 (SPSS，Chicago，IL，USA)軟件來(lái)分析數(shù)據(jù)，用Duncan’s multiple range test來(lái)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。

1.7　MHC Ⅱ β多態(tài)性初步分析

以對(duì)照組反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模版，利用引物MHCⅡβ-full-F和MHCⅡβ-Intron3，4-R擴(kuò)增ORF，一共選取了25尾羅非魚(yú)50個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，用于分析MHCⅡβ基因的多態(tài)性。反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min(39cycles)；72 ℃，10 min，PCR產(chǎn)物4 ℃保存。

利用引物MHCⅡβ-sscp-F和MHCⅡβ-sscp-R對(duì)易感個(gè)體和抗性個(gè)體羅非魚(yú)的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將10 μL PCR產(chǎn)物和等體積的變性緩沖液混合均勻，55 ℃變性5 min，變性樣品在220 V，w=10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳過(guò)夜，銀染顯色，目的片段溶于DNA洗脫緩沖液過(guò)夜，擴(kuò)增目的片段進(jìn)行PCR純化測(cè)序。

測(cè)序獲得的目的基因序列由DNAtools 6.0 軟件預(yù)測(cè)并翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列；蛋白序列多重比對(duì)使用Clustal X 1.8 軟件；進(jìn)化樹(shù)由Mega 4.0 軟件構(gòu)建。

2　結(jié)　果

2.1　羅非魚(yú)MHC Ⅱ β cDNA全長(zhǎng)及基因組序列分析

本實(shí)驗(yàn)獲得的尼羅羅非魚(yú)MHCⅡβ中間片段長(zhǎng)度為415 bp，3′片段長(zhǎng)度約為760 bp，5′片段長(zhǎng)度約為300 bp，將已測(cè)序的羅非魚(yú)的MHCⅡβ中間片段，3′片段和5′片段序列根據(jù)重疊部分堿基序列進(jìn)行拼接，獲得了羅非魚(yú)MHCⅡβ的全長(zhǎng)cDNA為1 142 bp，其中，5′非編碼區(qū)24 bp，開(kāi)放讀碼框(open reading frame， ORF)750 bp，3′非編碼區(qū)368 bp。經(jīng)BLAST比對(duì)后，確認(rèn)為尼羅羅非魚(yú)MHCⅡβ基因序列。

利用3組特異性引物，分別從同一個(gè)羅非魚(yú)個(gè)體的基因組中進(jìn)行內(nèi)含子的PCR擴(kuò)增，得到5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子。其中外顯子1編碼前導(dǎo)肽，內(nèi)含子1為227 bp，外顯子2和外顯子3編碼β結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含子2為280 bp，內(nèi)含子3為90 bp，外顯子4為跨膜區(qū)，存在保守的GXXGXXXGXXXXXXG框，內(nèi)含子4為259 bp，外顯子5編碼胞內(nèi)區(qū)和3′UTR，并且有一個(gè)脊椎動(dòng)物典型的加尾信號(hào)AATAAA和41 bp的PolyA尾巴(圖1)。

羅非魚(yú)MHCⅡβ的開(kāi)放讀碼框?yàn)?50 bp，編碼249個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為27 990，理論的等電點(diǎn)為6.38。經(jīng)過(guò)SignalP3.0分析發(fā)現(xiàn)1-18號(hào)氨基酸為信號(hào)肽序列。

根據(jù)Kelin等[27]的命名規(guī)則將其編碼的氨基酸序列命名為Orni-DAB*0101，Orni是根據(jù)羅非魚(yú)的拉丁學(xué)名Oreochromisniloticus的頭兩位字母，D是指MHCclass Ⅱ，A指基因家族命名，B指β鏈。

圖1　羅非魚(yú)MHCⅡβ基因結(jié)構(gòu)及其推導(dǎo)的氨基酸序列。起始密碼子、終止密碼子、mRNA加尾信號(hào)用陰影表示?？缒^(qū)用橫線標(biāo)出。Fig.1　Genomicsequence of Nile tilapia MHCⅡβ gene.The starting codon, stop codon and the mRNA polyadenylation signal (AATAAA) are shaded.Transmembrane domain marked by a line

2.2　同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

采用Clustal X 1.8軟件對(duì)該氨基酸序列和其他魚(yú)類、鼠和人的MHCⅡβ氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，再用Mega 4.0軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(基因登陸號(hào)見(jiàn)表2)。同源性分析顯示(表3)，其中羅非魚(yú)和鱸形目的駝背非鯽、斜帶石斑魚(yú)、舌齒鱸、大黃魚(yú)的同源性分別為78.6%、70.8%、70.5%、70.1%，和鳉形目青鳉的同源性為69.7%，和鰈形目圓斑星鰈、半滑舌鰨的同源性分別為65.1%、66.4%，和刺魚(yú)目三刺魚(yú)的同源性為66.1%，和鯉形目、鮭形目的同源性相對(duì)較低，和人及鼠的同源性僅為30.6%和32.5%。

根據(jù)羅非魚(yú)和部分硬骨魚(yú)、鼠及人的MHCⅡβ氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明(圖2)，羅非魚(yú)的MHCⅡβ基因與鱸形目(駝背非鯽、石斑魚(yú)、舌齒鱸、大黃魚(yú))的進(jìn)化關(guān)系最近，與鳉形目(青鳉)，刺魚(yú)目(三刺魚(yú))、鰈形目(圓斑星鰈、半滑舌鰨)的進(jìn)化關(guān)系相對(duì)于鮭形目(大西洋鮭、虹鱒)、鯉形目(斑馬魚(yú)、鯉魚(yú))而言，進(jìn)化關(guān)系更近，與鼠和人的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

表 2　用于系統(tǒng)樹(shù)建立和序列比對(duì)的MHC氨基酸序列Table 2　The MHC amino acid sequences using for alignment and construction of phylogenic tree

表 3　羅非魚(yú)MHCⅡβ與其它物種MHCⅡβ同源性比較Table 3　Identities of MHCⅡβ between Nile tilapia and other species　%

2.3　MHC Ⅱβ基因組織分布及感染后表達(dá)量變化分析

根據(jù)設(shè)計(jì)的特異性引物，通過(guò)Real-time PCR進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，對(duì)羅非魚(yú)MHCⅡβ基因在不同組織中的表達(dá)進(jìn)行分析，以18S rDNA作為內(nèi)參。結(jié)果顯示(圖3)，在健康的羅非魚(yú)各組織中，MHCⅡβ較強(qiáng)的表達(dá)于鰓、心臟、脾臟、胃，中度表達(dá)于腦、垂體、腎臟、肌肉等組織中，在皮膚、腸、肝臟、胸腺等組織中表達(dá)較弱。

人工感染海豚鏈球菌后，頭腎組織中MHCⅡβ基因發(fā)生了變化。從圖中可以看出(圖4)，MHCⅡβ基因的表達(dá)量從0～6 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，12 h顯著性下降，從24～48 h呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在48 h與對(duì)照組表達(dá)量基本持平，但是之后繼續(xù)下降，72 h出現(xiàn)顯著性下降，一直到96 h和120 h都表現(xiàn)出顯著性下降。

圖 2　基于MEGA4.0軟件中的鄰接法構(gòu)建，羅非魚(yú)MHCⅡβ基因與其他物種的進(jìn)化樹(shù)分析，檢驗(yàn)自展值(bootstrap)為1 000Fig.2　Phylogenetic analysis of MHCⅡβ in Nile tilapiaand other vertebrates.Phylogenetic analysis was done using MEGA 4.0 by performing the Neighbor-Joining method with 1 000 bootstrap replicates

圖3　羅非魚(yú)MHCⅡβ基因的組織表達(dá)特異性Real-time PCR分析Fig.3　Real-time PCR analysis of MHCⅡβ expression in various tissues of Nile tilapia

圖4　攻毒后頭腎組織MHCⅡβ基因表達(dá)量變化，*表示P<0.05Fig.4　Expression of MHCⅡβ in headkidney during challenging,*P<0.05

2.4　羅非魚(yú)MHC Ⅱβ基因多態(tài)性初步分析

通過(guò)對(duì)25尾羅非魚(yú)的開(kāi)放讀碼框50個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示(圖5)，有10種不同的MHCⅡβ核苷酸序列，分別編碼10種不同的氨基酸序列，分別被命名為Orni-DAB0101、Orni-DAB0201、Orni-DAB0301、Orni-DAB0401、Orni-DAB0501、Orni-DAB0601、Orni-DAB0701、Orni-DAB0801、Orni-DAB0901、Orni-DAB1001。與其他9種氨基酸相比，Orni-DAB0601發(fā)現(xiàn)了4個(gè)氨基酸的增添。在開(kāi)放讀碼框編碼的249個(gè)氨基酸中，共出現(xiàn)104個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，占編碼的總氨基酸數(shù)的41.8%；第2外顯子編碼的氨基酸的多態(tài)點(diǎn)數(shù)為66個(gè)，占整個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的63.5%。由此可見(jiàn)，羅非魚(yú)的MHCⅡβ基因有豐富的多態(tài)性，而且在第2外顯子上的多態(tài)性最高。

根據(jù)NJ法構(gòu)建的10種氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖6)，結(jié)果明顯分為A和B兩支(圖6)，分支A包括Orni-DAB0101、Orni-DAB0201、Orni-DAB0301、Orni-DAB0401、Orni-DAB0501、Orni-DAB0601、Orni-DAB0901，分支B包括Orni-DAB0701、Orni-DAB0801、Orni-DAB1001。同源性分析顯示(表4)，GroupA中，Orni-DAB0101和Orni-DAB0601，Orni-DAB0201，Orni-DAB0301，Orni-DAB0901，Orni-DAB0401，Orni-DAB0501的同源性分別為96.0%，98.8%，97.2%，83.3%，86.6%，80.2%，Group A中，序列之間的同源性比較高，而在Group B中，Orni-DAB0701和Orni-DAB0801，Orni-DAB1001的同源性為75.9%，78.3%，序列之間的同源性相對(duì)較低。

圖5　羅非魚(yú)MHCⅡβ基因的10種氨基酸序列比對(duì)Fig.5　Multiple alignments of MHCⅡβ amino acid sequences from Nile tilapia

表4　羅非魚(yú)MHCⅡβ基因10種序列同源性比較Table 4　Identities of ten sequences of MHCⅡβ from Nile tilapia　%

另外，通過(guò)全長(zhǎng)驗(yàn)證引物從1尾羅非魚(yú)中，擴(kuò)增ORF，在選擇的15個(gè)陽(yáng)性克隆中，測(cè)序得到4個(gè)不同的序列，編碼4種不同的氨基酸序列，這可能暗示著羅非魚(yú)的MHCⅡβ基因可能至少存在2個(gè)不同的基因座(圖7)。

利用引物MHCⅡβ-sscp-F和MHCⅡβ-sscp-R對(duì)易感個(gè)體和抗性個(gè)體羅非魚(yú)的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物55 ℃變性后進(jìn)行SSCP電泳。出現(xiàn)2～12條不同的帶型(圖8)，暗示存在至少3個(gè)基因座。通過(guò)對(duì)易感個(gè)體和抗病個(gè)體的PCR-SSCP產(chǎn)物回收測(cè)序，發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)第2外顯子存在較多的基因型，每個(gè)個(gè)體存在1～6個(gè)基因型，說(shuō)明至少存在3個(gè)基因座(圖9)。在易感個(gè)體和抗性個(gè)體出現(xiàn)了豐富的第2外顯子基因型，為優(yōu)化條件進(jìn)一步篩選基因型提供了可能性。

3　討　論

3.1　尼羅羅非魚(yú)MHC Ⅱβ基因序列分析

MHC在適應(yīng)性免疫過(guò)程中起著抗原遞呈的作用，所以其在免疫系統(tǒng)中的作用十分重要。基因的克隆和序列分析是進(jìn)行功能分析的基礎(chǔ)工作。至今，多種魚(yú)類的MHC基因已經(jīng)被克隆和分析，包括牙鲆[12]、大菱鲆[13]、真鯛[28]、大西洋鮭[6]、鯉魚(yú)[2]、虹鱒[3]等。本文克隆了尼羅羅非魚(yú)MHCⅡβ基因的cDNA全長(zhǎng)，獲得了MHCⅡβ基因組序列，cDNA全長(zhǎng)為1 142 bp，開(kāi)放讀碼框?yàn)?50 bp，編碼249個(gè)氨基酸?；蚪M序列含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，但是內(nèi)含子的大小有明顯不同。外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目和半滑舌鰨[29]、大菱鲆[13]、牙鲆[12]一樣，并且跨膜區(qū)含有GXXGXXXGXXXXXXG框，有學(xué)者研究表明該框和αβ二聚體的形成有關(guān)[30]。PANG等[31]研究發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚(yú)的MHCⅡβcDNA 序列全長(zhǎng)為1 119 bp，開(kāi)放讀碼框?yàn)?50 bp，也是編碼249個(gè)氨基酸。但是含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，與本文的主要差異在β2結(jié)構(gòu)域是由2個(gè)外顯子編碼，中間被一個(gè)內(nèi)含子隔離。這可能是因?yàn)閮烧呤褂玫哪崃_羅非魚(yú)來(lái)源不同所致，也可能是因?yàn)槟崃_羅非魚(yú)MHCⅡβ多態(tài)性較豐富，導(dǎo)致了基因組序列的差異。

圖6　基于MEGA4.0軟件中的NJ方法，羅非魚(yú)MHCⅡβ基因10種序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，檢驗(yàn)自展值(bootstrap)為1 000Fig.6　Phylogenetic analysisof ten sequences MHCⅡβ in Nile tilapia.Phylogenetic analysis was done using MEGA 4.0 by performing the Neighbor-Joining method with 1 000 bootstrap replicates

圖7　同一個(gè)體MHCⅡβ基因的氨基酸序列比對(duì)Fig.7　Multiple alignments of MHCⅡβ amino acid sequences in one individual

圖8　羅非魚(yú)第二外顯子PCR-SSCP電泳圖(數(shù)字代表?xiàng)l帶數(shù)目)Fig.8　PCR-SSCP analysis of exon2 in different individuals(Figures represented the number of bands)

圖9　同一個(gè)體MHCⅡβ基因的第2外顯子編碼的氨基酸序列比對(duì)Fig.9　Multiple alignments of amino acid sequence encoded by exon 2 in one individual

通過(guò)對(duì)尼羅羅非魚(yú)MHCⅡβ基因的氨基酸與其他魚(yú)類及人和鼠的進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，羅非魚(yú)的MHCⅡβ基因和鱸形目的MHCⅡβ基因同源性都在70%以上，和鳉形目、鰈形目、刺魚(yú)形的同源性低于鱸形目，和哺乳動(dòng)物如人和鼠的同源性最低。從進(jìn)化樹(shù)的總體來(lái)看，魚(yú)類的MHCⅡβ基因聚類，哺乳類的MHCⅡβ基因聚類，羅非魚(yú)和鱸形目魚(yú)類的進(jìn)化關(guān)系最近，和哺乳動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)，這個(gè)結(jié)果與羅非魚(yú)的分類地位相一致。

3.2　MHC Ⅱ β基因組織表達(dá)分析

利用Real-time PCR技術(shù)，對(duì)健康尼羅羅非魚(yú)組織中的MHCⅡβ基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在羅非魚(yú)中，鰓、心臟、脾臟、胃等組織中較強(qiáng)表達(dá)MHCⅡβ基因，皮膚、肝臟等組織表達(dá)最弱，腦、垂體等中度表達(dá)，這和在真鯛、牙鲆表達(dá)有相似的地方。真鯛[28]正常組織中，MHCⅡβ基因較強(qiáng)表達(dá)于鰓、脾臟、頭腎、胃、小腸等組織中，肌肉中的表達(dá)最弱；牙鲆[12]中MHCⅡβ基因廣泛表達(dá)于各個(gè)組織中，鰓、脾、頭腎表達(dá)量較高，小腸較低。從中我們可以看出來(lái)，脾臟在很多魚(yú)類中都較高表達(dá)MHCⅡβ基因，這可能是和脾臟是重要的免疫器官有關(guān)。另外，魚(yú)的鰓組織中MHCⅡβ基因的表達(dá)量也比較高，這可能和鰓是黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分，含有豐富的淋巴細(xì)胞有關(guān)[32]。當(dāng)然，不同的種魚(yú)MHCⅡβ基因的表達(dá)有著自身的特點(diǎn)。

人工感染海豚鏈球菌后，檢測(cè)了MHCⅡβ基因在尼羅羅非魚(yú)頭腎中的表達(dá)變化。與對(duì)照組相比，整體呈現(xiàn)下降-上升-下降的變化趨勢(shì)。從0～6 h，MHCⅡβ基因的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，12 h表達(dá)量顯著下降，之后從24～48 h該基因表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在48 h表達(dá)量與對(duì)照組基本持平，但是之后繼續(xù)下降，72 h出現(xiàn)顯著性下降，一直到96 h和120 h都表現(xiàn)出顯著性下降。鰻弧菌感染后，真鯛[28]的肝臟、脾臟、頭腎腸等組織的MHCⅡβ基因表達(dá)量變化從5 h到72 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在HINV病毒感染72 h后，虹鱒[33]脾臟和前腎的MHCⅡβ基因表達(dá)量發(fā)生了下降，192 h后逐漸恢復(fù)。大菱鲆[13]感染鰻弧菌后肝和腎組織中MHCⅡβ的表達(dá)量在24～48 h內(nèi)出現(xiàn)下調(diào)，之后開(kāi)始上升。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前人的研究既有相似之處也有不同，MHCⅡβ基因的表達(dá)量發(fā)生了下調(diào)，但是最終未恢復(fù)到正常水平。這一方面可能是因?yàn)楸疚牟捎昧烁咧滤懒繉?duì)魚(yú)類進(jìn)行了攻毒，使免疫系統(tǒng)造成了一定的破壞，另一方面也有可能是與取樣時(shí)間有關(guān)。至于MHCⅡβ基因在魚(yú)體內(nèi)發(fā)揮免疫功能的機(jī)理以及病原感染后MHCⅡβ基因表達(dá)量的變化都受哪些因素的影響等等這些問(wèn)題，還有待于進(jìn)一步研究。

3.3　MHC Ⅱ β基因多態(tài)性初步分析

魚(yú)類MHC基因的多態(tài)性在種內(nèi)和和種間都存在。本文通過(guò)25尾羅非魚(yú)的50個(gè)ORF陽(yáng)性克隆對(duì)MHC基因的多態(tài)性進(jìn)行了初步分析，共獲得10個(gè)MHCⅡβ等位基因，通過(guò)對(duì)它們編碼的氨基酸進(jìn)行比對(duì)和構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MHCⅡβ基因的多態(tài)性主要集中在第2外顯子上，在104個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中，66個(gè)出現(xiàn)在第2外顯子上。MHCⅡβ基因多態(tài)性在其他魚(yú)類中也廣泛存在，在長(zhǎng)江草魚(yú)[34]的3個(gè)群體的MHCⅡβ基因的克隆及測(cè)序分析中，共發(fā)現(xiàn)了34個(gè)等位基因。張玉喜等[12]從84尾牙鲆共411個(gè)克隆中得到了13個(gè)等位基因。

同時(shí)，從一個(gè)個(gè)體的ORF陽(yáng)性克隆中共獲得4條不同的核苷酸序列，分別編碼不同的氨基酸，暗示著羅非魚(yú)至少存在2個(gè)MHCⅡβ基因的座位。接下來(lái)的PCR-SSCP電泳結(jié)果顯示了類似的結(jié)果，從銀染后的結(jié)果可以看出，每個(gè)個(gè)體出現(xiàn)2～12條不同的帶型，說(shuō)明存在1到6個(gè)不同的等位基因，也說(shuō)明了在羅非魚(yú)中至少存在3個(gè)MHCⅡβ基因座。這個(gè)結(jié)果與Zhou等[35]在尼羅羅非魚(yú)中得到的結(jié)果一致。而學(xué)者利用PCR-SSCP檢測(cè)赤點(diǎn)石斑魚(yú)各組織的多態(tài)性研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MHCⅡβ基因在各組織的表達(dá)都具有豐富的多態(tài)性，在心臟表達(dá)等位基因的數(shù)量最少，但依舊有8個(gè)等位基因[36]。同時(shí)MHC基因的多態(tài)性和物種對(duì)疾病的抗性或易感具有相關(guān)性[14-22]，從這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，魚(yú)類MHCⅡβ基因的這種高度的多態(tài)性為其作為抗病基因篩選提供了理論上的可能性。

國(guó)內(nèi)學(xué)者陳松林等[37]在牙鲆的抗病基因篩選過(guò)程中，首先通過(guò)自然選擇和人工選擇篩選抗病的牙鲆魚(yú)苗和苗種，牙鲆性成熟后與日本引進(jìn)的有遺傳多樣性的牙鲆進(jìn)行牙鲆家系建立，建立半同胞家系和全同胞家系63個(gè)，對(duì)不同家系進(jìn)行鰻弧菌的感染實(shí)驗(yàn)，篩選出抗病家系和易感家系。這種家系選育和抗病選育相結(jié)合的方法更有利于篩選抗病基因。國(guó)外學(xué)者對(duì)大西洋鮭的研究也是采用家系選育和抗病基因相結(jié)合的方法。在大西洋鮭對(duì)細(xì)菌感染和病毒感染的抗病基因篩選中，先對(duì)50個(gè)家系進(jìn)行細(xì)菌和病毒的感染實(shí)驗(yàn)，篩選出易感家系和抗病家系，結(jié)合MHC基因型的篩選，成功的篩選出抗病基因型，再進(jìn)行F2帶家系進(jìn)行抗病家系和易感家系選育[21,38]。

而本文嘗試著從易感個(gè)體和抗病個(gè)體MHCⅡβ基因的第2外顯子分析中篩選出抗病基因，結(jié)果不盡人意。不過(guò)羅非魚(yú)的個(gè)體存在1～6個(gè)不同的等位基因，說(shuō)明了易感群體和抗病群體存在豐富的基因型。這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)用魚(yú)的遺傳背景比較復(fù)雜，因此下一步需要從全同胞家系或者是半同胞家系的樣品中進(jìn)行分析。在以后的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合家系選育和抗病基因篩選進(jìn)行抗病育種工作。

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