鄧冬梅，艾紅霞，鄧金川，廖斌

(1. 廣西科技大學生物與化學工程學院∥廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；2. 中山大學生態(tài)進化學院∥生物防治國家重點實驗室∥廣東植物資源重點實驗室，廣東 廣州510275)

超富集植物(hyperaccumulator)是指能夠超量吸收重金屬(或非金屬)并將其轉運到地上部分貯藏起來的植物，在重金屬污染土壤的植物修復中有重要應用潛力[1]。深刻探討超富集植物對重金屬的耐性和富集基因，對進一步利用基因技術提高重金屬污染土壤植物修復效率有重要意義[2]。相對于其他重金屬，在分子水平上對Pb超富集機理的探索很少[3]。

寶山堇菜Violabaoshanensis是我國發(fā)現(xiàn)的一種Cd超富集植物[4 - 5]，也具有較強的Pb耐性和富集能力[6]，因此，寶山堇菜為重金屬富集、耐性相關基因的研究提供了豐富的基因資源。但目前，基本沒有在分子水平上對寶山堇菜的Pb超富集機理的探索。

就發(fā)現(xiàn)與某一性狀相關基因的方法來講，抑制差減雜交(SSH)被認為是一種較為適合的技術，可在轉錄水平上發(fā)現(xiàn)兩材料間差異表達的基因[7]。據(jù)此，本研究利用SSH技術篩選寶山堇菜根在Pb脅迫下特異表達的EST(Expressed Sequence Tags)基因克隆片段，并選擇部分克隆片段分別進行半定量RT-PCR和Northern雜交分析驗證其表達特征，為從分子水平揭示寶山堇菜對Pb的耐性和富集機理提供參考。

1　材料與方法

1.1　植物材料

以組織培養(yǎng)獲得的無菌寶山堇菜為材料，選取大小一致，根系發(fā)達的無菌苗，流水洗去根表面瓊脂，于1/2 Hogland營養(yǎng)液中培養(yǎng)2周后用于后續(xù)實驗。

1.2　寶山堇菜SSH文庫構建

1.2.1 RNA提取和cDNA合成對預培養(yǎng)2周的寶山堇菜進行300 μmol/L Pb(NO3)2處理，并設立不加Pb的對照處理。處理2 d后，用Trizol方法提取兩個處理寶山堇菜根中的RNA，并利用OligotexTM mRNA純化試劑盒(QiaGen公司)分離RNA中的mRNA，利用Super SMARTTM cDNA反轉錄試劑盒(Clontech公司)合成cDNA，并利用QIAquick PCR Purification Kit(QiaGen公司)純化合成的cDNA。

1.2.2SSH差減雜交以Pb處理的cDNA為tester，以不加Pb對照處理為driver，利用PCR-Select cDNA Subtraction Kits(Clontech公司)構建SSH文庫。首先對tester和driver進行RsaI酶切，等分成兩份，分別連接上不同接頭，而Driver cDNA不連接頭。連有不同接頭的Tester cDNA分別與過量的Driver cDNA混合，進行兩次差減雜交。

1.2.3差異cDNA文庫建立及序列分析以雜交產(chǎn)物為模板，以接頭1和2R設計的巢式引物為引物，進行兩次抑制PCR。將2種雜交的PCR產(chǎn)物分別克隆至pGEM-T vector(Promaga公司)中，建立差異cDNA文庫。將有效克隆的菌液送去上海英竣公司測序，得到每個克隆的EST序列，所有的ESTs在NCBI的網(wǎng)站上(http∥www.ncbi.nlm.nih.gov)進行比對。

1.3　寶山堇菜Pb特異表達基因檢測

1.3.1植物處理及RNA提取對預培的寶山堇菜無菌苗分別進行不同濃度(0、60、300、600 μmol/LPb (NO3)2，處理2 d)和時間(0、1、2、7 d，處理濃度300 μmol/L Pb (NO3)2)的Pb處理，及不同脅迫處理(300 μmol/LCdSO4，100 mmol/L NaCl和φ=37%的H2O2，處理1 d)。處理結束后，利用2.2中方法提取各處理寶山堇菜根和葉片中RNA。

表1　PS10、PS13號EST克隆片段及18S rRNA RT-PCR特異引物Table 1　Primer sequences of RT-PCR of PS10, PS13 gene clone, and 18S rRNA

1.3.2半定量PCR利用OmniscriptTMReverse Transcriptase(QiaGen公司)合成cDNA第一鏈。以寶山堇菜體內18S rRNA擴增片斷為內參。為研究PS10和PS13號EST克隆片段在寶山堇菜中的表達特性，利用Primer Premier 5設計18S rRNA及PS10和PS13號EST克隆片段上下游擴增特異引物(表1)，并利用設計引物進行半定量PCR。

反應體系(25 μL)包括: ExTaq酶mix 19 μL，cDNA第一鏈模板2.0 μL，上下游引物各2 μL。PCR溫度程序為：94 ℃預變性1 min，94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)28次，最后72 ℃終延伸7 min，4 ℃保存。PCR樣品進行w=2%瓊脂糖膠電泳，目的條帶與18S rRNA條帶的強度比代表了目的基因的相對表達水平。

1.4　Northern 印跡轉移

對2.1中提取的各處理的RNA進行w=1.2%瓊脂糖電泳，電泳完畢后，將RNA從凝膠轉移到帶正電的尼龍膜上，并通過紫外交聯(lián)固定于膜上。

提取需要檢測的克隆片段的質粒DNA，然后采用SSH技術中的第一次PCR的程序進行擴增，PCR產(chǎn)物純化后作為探針模板。同時利用Oligo-labelling Kit(TaKaRa公司)進行【α-32P】dCTP探針制備。將轉接有RNA的尼龍膜在42 ℃預雜交4 h后，加入5 μL已標記好的探針，42 ℃下進一步雜交16 h，然后洗去未雜交探針，壓入磷屏進行放射自顯影，在臺風(Typhoon)儀器上讀取磷屏數(shù)據(jù)。

2　結果與討論

2.1　RNA、cDNA及文庫質量檢測

對照與Pb處理下寶山堇菜根中的RNA電泳可看到28S rRNA 和18S rRNA的清晰條帶，無托尾現(xiàn)象，并且28S rRNA條帶近乎是18S rRNA條帶寬度的2倍，另外看不到基因組DNA以及蛋白污染(圖1)，說明提取的RNA質量較好，無降解。

圖1　寶山堇菜對照和300 μmol/L Pb處理根中總RNA1.CK；2.300 μmol/L Pb2+Fig.1　Total RNA of control and 300 μmol/L Pb in V. baoshanensis root 1. CK; 2. 300 μmol/L Pb2+

圖2　寶山堇菜cDNA合成及RsaⅠ酶切產(chǎn)物的電泳檢測Fig.2　Double strand cDNA syntheses of V. baoshanensis and its Rsa Ⅰ digestion 1和2分別為對照和Pb處理的雙鏈cDNA；3和4分別為對照和Pb處理的酶切產(chǎn)物

圖3　SSH文庫部分克隆質粒的PCR產(chǎn)物Fig.3　PCR detection of partial clone plamid of SSH library 1-11： the PCR product of clone plasmid

寶山堇菜對照和Pb處理的雙鏈cDNA分布在0.2～2 kb之間，在0.5～1 kb之間的豐度較高，說明雙鏈cDNA的完整性有保證，能充分代表mRNA在片段分布及豐度上的特點。而RsaI酶切產(chǎn)物的分布范圍為0.1～1 kb，最高豐度在500 bp左右，分布范圍明顯縮小，說明酶切效果明顯(圖2)。PCR檢測結果顯示，文庫中絕大部分克隆含有插入片段，片段大小介于150～1 000 bp之間，平均的插入片段大小約500 bp左右(圖3)。

2.2　EST測序分析

檢索結果顯示隨機測序的140個克隆代表40個獨立片段，片段大小在120～890 bp之間，有27個獨立片段與已知基因有同源性(表2)，它們在細胞生命活動過程中有著很廣泛的作用，根據(jù)其功能分為5類：① 抗氧化酶類；② 脅迫蛋白類；③ 信號轉導類；④ 代謝相關；⑤ 其它功能待確定cDNA(表2)。這些與EST克隆片段同源性較高的基因很多也為重金屬脅迫、解毒相關基因，如IIB型Ca-ATP酶(type IIB calcium ATPase)[8 - 9]，泛素延長蛋白(ubiquitin extension protein)[10 - 11]，金屬硫蛋白基因(putative metallothionein-like protein (Mt2) mRNA)[12 - 13]等，另外還有一些與其他脅迫相關的基因，如：琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase)[14 - 15]，磷酸甘油酸變位酶(phosphoglyceromutase)[16 - 17]。說明寶山堇菜對Pb脅迫的響應也有很多脅迫相關基因表達，且不是一個簡單的調控過程，而是一個整體層面的反應。

表2　利用SSH技術篩選出的差異表達克隆在GeneBank中的核酸同源性比較結果Table 2　Blastn results of the different expressed clones via SSH comparing with the genes in GeneBank

圖4　PS10號和PS13號克隆的RT-PCR半定量分析Fig.4　RT-PCR analysis of the expression of the PS10 and PS13 clone

2.3　半定量RT-PCR和Northern雜交分析

文庫中和Sesamumindicum木質素轉糖基酶(xyloglucan endotransglycosylase, XTH)基因同源的PS10號EST克隆片段在Pb脅迫下寶山堇菜根和葉中均屬上調表達，其表達量隨脅迫濃度增加先升高，在300 μmol/L Pb最高，脅迫濃度繼續(xù)升高時表達量略有下降，此外該克隆片段表達量隨脅迫時間的延長逐漸上升，但對其他脅迫響應不太明顯(圖4，圖5)。木質素轉糖基酶催化木質素的水解，受赤霉素GA3等植物激素調節(jié)，在細胞壁延伸和重建過程中起作用[18]。在菟絲子侵染、干旱、低溫和高鹽脅迫和蚜蟲噬咬下，該基因都有表達[19 - 20]。Krzesowska等[21]研究表明細胞壁的增厚是很多植物對Pb脅迫的主要響應方式。擬南芥屬、雜交白楊和浮萍等不同植物在收到Pb脅迫后都出現(xiàn)細胞壁的增厚，以將更多的Pb固定在細胞壁上。寶山堇菜中，木質素轉糖基酶的上調表達是否和此過程相關需要進一步實驗來解釋。但木質素轉糖基酶基因對其他脅迫沒有明顯響應說明不同植物對脅迫的響應機制是不相同的。

圖5　PS10號克隆的Northern分析Fig.5　Northern hybridization of the PS10 clone

文庫中PS13號克隆片段和GTP結合蛋白(GTP binding mRNA)同源性很高。GTP結合蛋白可能在Ca離子，茉莉酸(JAs)和水楊酸(SA)等介導的信號傳導途徑中起到重要的作用，為細菌侵染和高溫等脅迫下的響應基因[22 - 23]。JAs和SA介導的信號傳遞途徑與植物抗性密切相關，且JAs的積累也和重金屬Cu和Cd的抗性有關[24]。但GTP結合蛋白和Pb脅迫間的直接相關關系目前還沒有報道。PS13號EST克隆片段隨Pb脅迫濃度的增加，表達量逐漸增加，在600 μmol/L Pb時達到最大。在葉中，該片段表達量的變化和Pb脅迫濃度增加無明顯關系。300 μmol/L Pb脅迫下，隨處理時間的延長，寶山堇菜根和葉中該片段的表達量也逐步上升，處理時間為7 d時表達量最大。對其他脅迫，該片段在寶山堇菜根和葉中的變化基本不明顯，Na脅迫下，在寶山堇菜葉中表達量略有增加(圖4、圖6)。這說明，寶山堇菜根中，Pb脅迫下，GTP結合蛋白基因可能是上調表達基因，GTP結合蛋白可能參與Pb脅迫信號的傳導，其作用方式需進一步研究。

圖6　PS13號克隆的Northern分析Fig.6　Northern hybridization of the PS13 colone

3　結　論

1)利用SSH技術篩選得到27個在Pb脅迫下特異表達的EST基因克隆片段，這些基因在植物體內執(zhí)行多種功能，說明寶山堇菜對Pb脅迫的響應是一個整體層面的靈敏反應。

2)半定量RT-PCR和Northern雜交分析表明，與GTP結合蛋白、木葡聚糖內源轉糖基酶基因相似性高的2個克隆片段在寶山堇菜根中為Pb脅迫上調表達基因。Pb脅迫下，木葡聚糖內源轉糖基酶可能參與寶山堇菜在Pb脅迫下的生理調節(jié)反應，而GTP結合蛋白可能直接參與寶山堇菜體內Pb脅迫信號的傳導。

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