阮楚晉，潘麗霏，劉潔，劉祎，肖咪云，陸祖軍,2,3

(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林541004；2.珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林541004；3.廣西高校野生動(dòng)植物生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林541004)

濕地具保持水源、凈化水質(zhì)、蓄洪抗旱、維護(hù)生物多樣性等重要的環(huán)境調(diào)節(jié)功能和生態(tài)效益，也蘊(yùn)含豐富的微生物資源[1]。廣西會(huì)仙濕地是中國(guó)最大的巖溶濕地之一，其地貌獨(dú)特，是廣西熱帶、亞熱帶巖溶峰林地貌最大、最有研究?jī)r(jià)值的典型濕地。由于人類活動(dòng)的增加，農(nóng)藥的濫用和生活污水的隨意排放，導(dǎo)致該濕地富營(yíng)養(yǎng)化和污染加劇[2-3]。藍(lán)運(yùn)華、江紹峰等[4-5]研究表明農(nóng)藥百草枯質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于120 μg/g抑制會(huì)仙濕地底泥微生物代謝活性，并通過(guò)測(cè)定在百草枯作用下22 ℃時(shí)會(huì)仙濕地微生物生長(zhǎng)周期各個(gè)階段的代謝熱發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)2個(gè)產(chǎn)熱指數(shù)期，表明同一群落微生物改變了體內(nèi)一些重要酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。余麗娟等[6]研究該濕地的細(xì)菌菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)和糞大腸菌群數(shù)的季節(jié)變化動(dòng)態(tài)，表明夏季較其他三季相比在以上3個(gè)方面均有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)。但尚未見(jiàn)對(duì)該濕地底泥微生物多樣性的報(bào)導(dǎo)，而揭示該濕地的微生物多樣性特征，對(duì)其生態(tài)修復(fù)有重要的指導(dǎo)意義。本論文采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)的方法分離獲得了會(huì)仙濕地底泥樣品中的微生物，測(cè)定和分析分離菌株的16S rRNA基因序列，初步揭示該濕地底泥中的可培養(yǎng)微生物的群落組成特點(diǎn)和它們的重金屬抗性，結(jié)合該底泥樣品中高質(zhì)量濃度五氯硝基苯耐藥性菌株的分離分析，探討它們對(duì)環(huán)境污染狀態(tài)的指示意義。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1樣品采集2015年10月利用底泥采樣器按《湖泊富營(yíng)養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范》[7]進(jìn)行采集樣品，采集點(diǎn)為會(huì)仙濕地睦洞湖泊(110°E 25°N)東南西北四個(gè)角離岸2 m處及中央位置5個(gè)區(qū)域中水流速度緩慢的溝渠底泥各5份，每份質(zhì)量約500 g，剔除雜物和2 mm以上的沙礫，以四分法將5份樣品等量縮為一份質(zhì)量500 g的土樣[8]。采樣過(guò)程中用無(wú)菌手套取出樣品并去除樣品外圍可能污染的部分，放至無(wú)菌袋中。當(dāng)日運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：5 g/L Tryptone、2.5 g/L Yeast extract、5 g/L NaCl、12 g/L Agar；高氏一號(hào)培養(yǎng)基：20 g/L可溶性淀粉、1 g/L KNO3、0.5 g/L NaCl、0.5 g/L K2HPO4、0.5 g/L MgSO4、0.01 g/L FeSO4、12 g/L Agar。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株的分離菌株的分離主要參照蘇進(jìn)進(jìn)[9]的相關(guān)方法進(jìn)行，以無(wú)菌磷酸鹽緩沖生理鹽水(8.0 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.15 g/L Na2HPO4、0.2 g/L KH2PO4，pH 7.3)懸浮2 g濕泥，28 ℃、170 r/min振蕩40 min，10-1和10-2梯度稀釋后取50 μL涂布固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～5 d后，根據(jù)涂布后肉眼觀察平板菌落表面形態(tài)、菌落邊緣形態(tài)、菌落隆起形態(tài)、透明度等菌落特征，盡可能挑選有差異的菌落于LB和高氏一號(hào)培養(yǎng)基中擴(kuò)繁，平板劃線法純化獲得純菌。

1.2.2菌株DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增菌株DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增參照TANG Y W等[10]的實(shí)驗(yàn)方法。取0.5 mL純菌液至1.5 mL離心管中，沸水水煮15 min后液氮速凍，重復(fù)3次。懸浮液12 000 r/min離心5 min，取1 μL上清液作為模板；以27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)為引物進(jìn)行16S rRNA基因的擴(kuò)增； PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 10 min; 95 ℃ 45 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min 30 s, 30個(gè)循環(huán); 72 ℃10 min； PCR產(chǎn)物經(jīng)w=1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，回收和純化1 500 bp的DNA片段，送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.2.3菌株16S rRNA基因序列分析將的得到的16S rRNA基因序列用DNAMAN軟件進(jìn)行排序并獲得相似性矩陣，相似性≥97%的序列被認(rèn)為來(lái)自相同分類單元(OTU, operational taxonomic unit)[11]，用其中一個(gè)序列和菌株作為代表提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)并獲得該數(shù)據(jù)庫(kù)的收錄號(hào)(MF289499～ MF289521)，將每一個(gè)序列進(jìn)行BLAST (http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)相似性比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果選取參照序列，用Clustal X1.83進(jìn)行排序，mega 5.0[12]軟件基于NJ法構(gòu)建會(huì)仙濕地分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4有機(jī)砷耐受性檢測(cè)在所分離菌株的培養(yǎng)基中加入100、200、500 mg/L對(duì)氨基苯胂酸，驗(yàn)證菌株對(duì)有機(jī)砷耐受度。

1.2.5耐PCNB菌種的富集、馴化用9 mL丙酮溶解0.01 g PCNB，滴加1 mL吐溫作為增溶劑，配成PCBN質(zhì)量濃度為1 g/L的母液，再量取PCNB母液加入到100 mL液體LB培養(yǎng)基中，使得培養(yǎng)液中五氯硝基苯的質(zhì)量濃度為10 mg/L，取底泥樣品10 g接入到含有PCNB的液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃震蕩培養(yǎng)一周后取1 mL菌液接種到新的培養(yǎng)基中，7 d為一個(gè)轉(zhuǎn)接周期，按10、20、50、100、200 mg/L梯度依次提高培養(yǎng)液中五氯硝基苯的含量，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的富集培養(yǎng)之后從液體培養(yǎng)基中取樣涂布在含PCNB質(zhì)量濃度為300 mg/L的固體LB培養(yǎng)基平板內(nèi)，挑取單菌落進(jìn)行多次平板劃線純化菌株。

1.2.6PCNB含量檢測(cè)丙酮-石油醚萃取，磺化法處理，氣相色譜法測(cè)定。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，色譜-質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，離子源溫度為250 ℃，四極桿溫度150 ℃；色譜升溫程序：初始溫度80 ℃，保持1 min，以30 ℃/min的速率升至210 ℃，保持10 min；載氣為氦氣，流量為1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL。

2　結(jié)果和討論

2.1　分離菌株多樣性分析

分離共獲得65株細(xì)菌純培養(yǎng)物，分屬于24個(gè)不同的OTUs。對(duì)這些菌株的16S rRNA基因序列的相似性分析結(jié)果(表1)表明，它們與已知菌株相似性均大于97%，其中43株菌的16S rRNA基因序列與厚壁菌門Firmicutes的芽孢桿菌屬Bacillus、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、Fictibacillus屬、Lysinibacillus屬和腸球菌屬Enterococcus中的菌株最相似，相似性97.29%～100%；10株與放線菌門Actinobacteria的鏈霉菌屬Streptomyces、紅球菌屬Rhodococcus中的菌株最相似，相似性99.03%～100%；7株與變形菌門Proteobacteria假單胞菌屬Pseudomonas、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、泛菌屬Pantoea、代爾夫特菌屬Delftia的菌株最相似，相似性98.87%～100%；5株與擬桿菌門Bacteroidetes的金黃桿菌屬Chryseobacterium最相似，它們的相似性均為99.48%。

基于16S rRNA基因的系統(tǒng)聚類分析表明， 會(huì)仙濕地底泥中可培養(yǎng)微生物中最優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌為芽孢桿菌Bacillus(35株，占53.85%)，其次是鏈霉菌Streptomyce(7株，占10.77%)和金黃桿菌Chryseobacterium(5株，占7.69%)，它們占所有分離株的72.31%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示厚壁菌門主要是芽孢桿菌Bacillus占會(huì)仙濕地可培養(yǎng)原核微生物分離株的53.85%，已有的研究表明，大部分芽孢桿菌在有機(jī)物含量高的條件下會(huì)大量繁殖[13]；菌株LB D14的16S rRNA基因與FictibacillusphosphorivoransCa7TT(JX258924)的相似性為99.86%，后者最先從富含磷元素的樣品中分離出，具有嗜酸除磷的特性[14]；菌株GS D8的16S rRNA基因與DelftialacustrisDSM21246T(EU888308)的相似性為99.93%，后者為肽聚糖降解菌，從富營(yíng)養(yǎng)化的環(huán)境中分離出[15]；采樣時(shí)我們也觀察到的水面瘋長(zhǎng)水葫蘆，由此推測(cè)，會(huì)仙濕地水體富營(yíng)養(yǎng)化，與之前藍(lán)運(yùn)華[2]等報(bào)道相一致。值得注意的是，可培養(yǎng)的細(xì)菌中不少種類與條件致病菌的16S rRNA基因具有較高的相似性，如菌株LB A9 與BacillusanthracisATCC 14578T(AB190217)的相似性為99.85%，后者可引起吸入性炭疽熱[16]；菌株LB D3與BacilluscereusATCC14579T(AE016877)的相似性100.00%，后者可引起腹瀉或嘔吐的食物中毒癥狀[17]；菌株GS A2與StenotrophomonasmaltophiliaMTCC434T(JALV01000036)的相似性為100%，后者也可能引起血流感染[18]；菌株ZYE A18與能引起敗血癥的PantoeabrenneriLMG5343T(EU216735)[19]的相似性為100.00%，而在已有的其它濕地底泥細(xì)菌多樣性的文獻(xiàn)報(bào)道中鮮有此類條件致病菌的報(bào)道，提示人為活動(dòng)已經(jīng)嚴(yán)重的影響了會(huì)仙濕地的原生態(tài)環(huán)境。另外，從該濕地底泥中也分離出一些具有特殊性能的細(xì)菌，如與菌株GS 39 16S rRNA基因相似性最高的StreptomycesharbinensisNEAU-Da3T(相似性99.78%)為具抗腫瘤活性的好氧菌，并能分解尿素[20]；與菌株ZYE C14相似性最高的Rhodococcusaetherivorans10bc312T(AF447391)(相似性為99.03%)是甲基叔丁基醚降解菌[21]；菌株Cu2(與DelftiatsuruhatensisT7T(AB075017)的同源性為98.87%)能對(duì)聚苯二甲酸乙二醇酯進(jìn)行同化[22]，這些菌出現(xiàn)與當(dāng)?shù)剞r(nóng)藥化肥的濫用有著直接的關(guān)系。

表1　會(huì)仙濕地底泥分離的可培養(yǎng)細(xì)菌16s rRNA基因序列相似性比較結(jié)果Table 1　Homologous comparison results based on the comparison of the 16S rRNA sequences of bacterias isolated from the sediment of Huixian wetland

2.2　有機(jī)砷耐受性分析

在24個(gè)屬的65個(gè)分離株中，有12個(gè)屬30株菌耐受對(duì)氨基苯胂酸，其耐受性均在100 mg/L及以上(表2)。在Bacillus中，具有耐受性的菌株占該屬分離株總數(shù)的29.41%。對(duì)氨基苯胂酸屬于芳香族氨基化合物，具有抗菌、抑菌的特點(diǎn)[23]，是一種全合成抗菌劑，常被添加到飼料中，用于醫(yī)治家禽細(xì)菌感染。會(huì)仙濕地有機(jī)砷耐受菌的出現(xiàn)從某種程度上說(shuō)明會(huì)仙濕地環(huán)境正受到的污染，也說(shuō)明了人類活動(dòng)對(duì)濕地生態(tài)環(huán)境的影響。由結(jié)果可見(jiàn)，有機(jī)砷抗性具有菌株特異性。已有的有機(jī)砷抗性菌隸屬8個(gè)屬，分別是芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬、Fictibacillus屬、Lysinibacillus屬、紅球菌屬、泛菌屬、代爾夫特菌屬、金黃桿菌屬，這些屬中只有部分菌株表現(xiàn)抗性，且耐收質(zhì)量濃度在不同菌株中存在一定差異。目前有報(bào)道芽孢桿菌能夠?qū)ι檫M(jìn)行生物積累[24]，這些耐受菌株的分離，可能在日后用于濕地生態(tài)修復(fù)和環(huán)境污染治理中。

2.3　耐PCNB菌種分離

分離出一株對(duì)PCNB具有強(qiáng)耐受性的菌株W2，耐受質(zhì)量濃度300 mg/L以上PCNB，經(jīng)16S序列比對(duì)，其與屎腸球菌屬EnterococcusfaeciumCGMCC1.2136T(AJKH01000109)菌株的相似度為100%。用全掃描質(zhì)譜方式對(duì)含PCNB培養(yǎng)基中的菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖2、圖3所示。根據(jù)氣相色譜-質(zhì)譜儀對(duì)樣品檢測(cè)的結(jié)果與質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最高的色譜峰與五氯硝基苯的匹配度為99.99%，其對(duì)五氯硝基苯無(wú)降解作用。

圖1　基于會(huì)仙濕地底泥可培養(yǎng)原核微生物16S rRNA基因序列的系統(tǒng)聚類樹Fig.1　Phylogenetic dendrogram based on the comparison of the 16S rRNA sequences of microbes isolated from the sediment of Huixian wetland

分離菌株編號(hào)典型菌株(登錄號(hào))相似性/%耐受質(zhì)量濃度/(mg·L-1)LBA9BacillusanthracisATCC14578T(AB190217)99.85100LBD3BacilluscereusATCC14579T(AE016877)100.00500LBB21BacillussafensisFO-36bT(ASJD01000027)99.24100LBD13PaenibacillusbarcinonensisBP-23T(AJ716019)98.28200LB311PaenibacillusagaridevoransDSM1355T(AJ345023)99.07200LBD14FictibacillusphosphorivoransCa7TT(JX258924)99.86200LBB19LysinibacillussphaericusKCTC3346T(AUOZ01000024)99.93200ZYEC14Rhodococcusaetherivorans10bc312T(AF447391)99.03200GSD8DelftialacustrisDSM21246T(EU888308)99.93500Cu2DelftiatsuruhatensisT7T(AB075017)98.87500ZYEA18PantoeabrenneriLMG5343T(EU216735)100.00200LBC12Chryseobacteriumgambrini5-1St1aT(AM232810)99.48200

在所發(fā)現(xiàn)的腸球菌中，很多菌種都具有極強(qiáng)的耐藥性，并且大多數(shù)腸球菌為多重耐藥菌株。腸球菌耐藥性包括固有耐藥、獲得性耐藥和耐受性，對(duì)青霉素、萬(wàn)古霉素、頭孢類、低質(zhì)量濃度氨基糖苷類等多種抗菌藥物呈現(xiàn)固有耐藥[25-27]。意大利科學(xué)家在鮮奶奶酪中發(fā)現(xiàn)的Enterococcuslactissp.具有毒力因子和抗生素耐藥性[28]。藍(lán)運(yùn)華[29]在會(huì)仙濕地的底泥中檢測(cè)出少量PCNB及其降解產(chǎn)物PCA。分離到的菌株W2為腸球菌，該菌株對(duì)PCNB具有極強(qiáng)的耐藥性，對(duì)PCNB的耐藥質(zhì)量濃度在300 mg/L以上，目前，已經(jīng)報(bào)道過(guò)細(xì)菌對(duì)PCNB的耐受性在200 mg/L以上[30]，而耐受能力在300 mg/L以上的細(xì)菌鮮有報(bào)道。在對(duì)多種藥物均具有耐受性的腸球菌的研究中，也很少有腸球菌耐受PCNB的報(bào)道。

圖2　提取樣品總離子流圖Fig.2　Ion chromatogram of samples extracted

通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用測(cè)定從菌液中所分離的物質(zhì)，由于色譜峰與五氯硝基苯的匹配度為99.99%，且在檢測(cè)的離子豐度圖中，離子強(qiáng)度最大的離子為237，237為PCNB的定量離子桿[31]，由此可判斷分離提取的物質(zhì)為PCNB，菌株W2對(duì)PCNB耐受性很強(qiáng)，但不具降解能力。PCNB耐受菌的出現(xiàn)，在一定程度上意味著當(dāng)?shù)匾咽艿睫r(nóng)藥的污染，生態(tài)環(huán)境遭到人為的破壞，并且其對(duì)殺菌藥物的耐受性值得引起足夠的重視，多重耐藥的特性使其一旦感染其它生物體致病后將難以進(jìn)行藥物治療，對(duì)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生極大的挑戰(zhàn)。

圖3　提取樣品全掃描離子相對(duì)豐度圖Fig.3　Full scan ion relative abundances of samples extracted

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