魏 侖 陳亞敏 張曉芳 郝建紅 辛 曉 吳靖芳 高福祿

(河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 1 2014級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生, 2 2014級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)形態(tài)學(xué)實驗教學(xué)中心， 張家口 075000;3 河北師范大學(xué)， 石家莊 050024)

哺乳動物原始造血系統(tǒng)始于胚外中胚層的卵黃囊。但近年的研究表明，永久造血首先起源于胚內(nèi)主動脈-性腺-中腎(aorta-gonad-mesonephros，AGM)區(qū)，從AGM區(qū)到胎肝遷移路徑可能是生成造血細胞的主要部位[1]。之后胎肝、脾、胸腺、淋巴結(jié)和骨髓開始造血，且生后造血器官的遷變?nèi)栽诶^續(xù)進行。在小鼠胚胎發(fā)育期間，造血系統(tǒng)的發(fā)生表現(xiàn)為多時間點的連續(xù)過程[2]。小鼠脾造血始于胚胎(embryonic period，E)15.5 d，由造血干細胞從卵黃囊血島或肝經(jīng)血液循環(huán)遷入脾的間充質(zhì)內(nèi)，并逐漸增殖分化形成紅細胞系、粒細胞系和巨核細胞血小板系，構(gòu)成髓樣造血結(jié)構(gòu)[3]。本研究對小鼠脾生后發(fā)育進行了連續(xù)的形態(tài)學(xué)觀察，旨在探索脾生后發(fā)育規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與試劑

隨機選取體重25～35 g的性成熟健康KM小鼠36只，12只雄性，24只雌性(河北北方學(xué)院實驗動物中心)。生理鹽水、Bouin固定液、蒸餾水、石蠟、梯度乙醇、二甲苯、蘇木精、伊紅、Giemsa染液、過碘酸、Schiff試劑、枸櫞酸緩沖液、兔CD36一抗、免疫組織化學(xué)ABC試劑盒。

1.2 取材

健康小鼠，雌雄比例按2∶1于晚18∶00合籠飼養(yǎng)，次日早7∶00檢查雌性小鼠陰栓，見陰栓之日起為妊娠(gestationday，GD)0 d。所有小鼠均飼養(yǎng)于自然光照充足的環(huán)境，自由進食。于 GD19 d 密切觀察孕鼠生產(chǎn)情況，生后仔鼠記為生后(puerperal，P)1 d。選擇P1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31 d小鼠為研究對象，采用頸椎脫臼處死法，開腹迅速取出小鼠脾，Bouin固定液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋。切片厚5 μm，裱貼于涂有APES的載玻片。

1.3 H-E染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染核5 min，鹽酸酒精分化，自來水返藍，0.5%伊紅水溶液染胞質(zhì)，脫水、透明，中性樹膠封片。

1.4 Giemsa染色

Giemsa染料100 g、甘油66 ml、甲醇66 ml配成儲備液。用前以PBS稀釋10倍。石蠟切片常規(guī)下脫蠟至水，將染液滴于玻片并完全覆蓋組織，室溫染色15～30 min，自來水沖洗，低濃度乙醇洗滌，鏡檢，常規(guī)脫水、透明、封片。

1.5 PAS染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，以蒸餾水清洗，將過碘酸滴于玻片使之完全覆蓋組織，室溫氧化10～15 min。以自來水沖洗5 min，Schiff試劑10～15 min，流水沖洗5 min。蘇木精復(fù)染胞核，脫水、透明封片。

1.6 免疫組織化學(xué)顯色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，pH 6.0的枸鹽酸緩沖液修復(fù)抗原，3%的H2O2溶液封閉20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶。滴加兔一抗CD36(1∶80)，4℃過夜，滴加羊抗兔lgG二抗37℃孵育30 min，滴加鏈霉卵白素-過氧化物酶37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染胞核，脫水，中性樹膠封片。陰性對照以PBS代替一抗，其余步驟不變。

1.7 巨核細胞及造血細胞計數(shù)

各級樣本均為隨機選取。各天數(shù)小鼠6只，1～7 d內(nèi)取整脾(此時脾臟體積較小)、9～31 d內(nèi)取中段脾做石蠟包埋，每個蠟塊每種染色依次每隔15張切片取1張，共10張，每張切片隨機選取10個完整視野，計數(shù)每個視野中巨核細胞及造血細胞的數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠脾生后的組織學(xué)特點

H-E染色顯示：P1 d小鼠脾紅髓較多，為散在的造血灶，可見大量紅細胞。白髓于P5 d開始出現(xiàn)，但結(jié)構(gòu)不典型，可見脾小結(jié)的結(jié)構(gòu)正在形成(圖1A、B，見封三)。紅白髓分界在P15 d左右時開始清晰，位于紅白髓交界處的邊緣區(qū)及邊緣竇也逐漸形成(圖2，見封三)。P31 d接近成年脾結(jié)構(gòu)。近被膜、血管及髓索處可見巨核細胞，且多聚集分布。巨核細胞體積巨大，核大而不規(guī)則，常呈折疊或扭曲狀、分葉狀。染色質(zhì)粗糙密集成塊、無核仁(圖3A，見封三)。巨核細胞及被膜小梁呈PAS陽性，巨核細胞呈聚集分布，且多靠近脾被膜、血管及髓索處(圖3B，見封三)。巨核細胞數(shù)量隨脾成熟不斷增加，直至成年趨于平穩(wěn)，PAS染色優(yōu)于H-E染色，2種染色總巨核細胞變化趨勢相同(圖4，見封三)。

H-E染色觀察到紅髓中有類似小淋巴細胞的造血細胞，核大而圓，染色致密呈深藍色，胞質(zhì)少而稀疏呈嗜堿性，隨脾成熟造血細胞不斷增加直至成年趨于平穩(wěn)(圖4，見封三)。Giemsa可清晰區(qū)分造血細胞，但對其他組織細胞著色能力較弱，呈淡藍色或無色(圖5，見封三)。

圖版說明(圖見封底)

2.2 巨核細胞分型

圖7 脾CD36免疫組織化學(xué)顯色顯示三型巨核細胞變化趨勢Fig 7 Changes of three types of megakaryocyte observed in mouse spleen by IHC

3 討論

哺乳動物脾可依據(jù)有無血竇分2種類型，小鼠屬無血竇型脾，以儲血功能為主[4]。本研究結(jié)果顯示，P1 d 脾紅髓較多，為散在的造血灶。白髓于P5 d開始出現(xiàn)，但結(jié)構(gòu)不典型，可見脾小結(jié)的結(jié)構(gòu)正在形成。紅白髓分界在P15 d左右時開始清晰。小鼠于P31 d仍存在有一定量的造血細胞，說明小鼠脾在生后仍具有一定的造血功能。丁劍冰等[5]報道小鼠脾始基于E12 d胃背系膜內(nèi)形成，E13 d形成原始血竇，E16 d偶見巨核細胞并具產(chǎn)血小板能力，E18 d開始增高，直到成年仍有大量的巨核細胞分布于紅髓。本研究通過H-E染色可觀察巨核細胞，但特異性較差，無法區(qū)分各型巨核細胞。PAS染色特異性隨脾成熟逐漸升高，在P15 d后僅巨核細胞及被膜小梁顯陽性反應(yīng)呈紅色，與丁劍冰等[5]的報道一致。PAS染色觀察巨核細胞優(yōu)于H-E染色，與李陽友等[6]的報道一致，但PAS也無法區(qū)分各型巨核細胞。本實驗巨核細胞和幼稚血細胞數(shù)量自出生至成年平穩(wěn)增加，可能與丁劍冰等[5]報道的巨核細胞E18 d開始升高有關(guān)，也提示生后脾持續(xù)造血，在血小板尤為顯著。O′Neill 等[7]進一步指出，脾基質(zhì)對于維持小鼠長期造血起重要作用[7]。本研究結(jié)果顯示：巨核細胞與造血細胞的變化趨勢大致相同，提示巨核細胞與原始造血細胞的成熟相伴隨，這與Klimchenko等[8]研究相符。Lefrancais等[9]報道小鼠肺是具有造血潛能的器官，并作為髓外產(chǎn)血小板的主要部位，可見小鼠脾生后仍具有造血功能[9]。小鼠脾在正常生理情況下即發(fā)揮終生造血能力，趨化因子CXCL12(SDF-1)在誘導(dǎo)肝、脾的髓外造血中起重要作用[10-11]。

巨核細胞是血小板的前體細胞，是人體唯一具有多倍體特征的正常細胞。巨核細胞的發(fā)生經(jīng)過造血干細胞、巨核系祖細胞、原巨核細胞、幼巨核細胞、顆粒型巨核細胞、產(chǎn)板型巨核細胞以及巨核細胞裸核[10]。CD36是細胞膜表面的一種糖蛋白和血小板反應(yīng)素受體，參與調(diào)節(jié)血小板聚集以及血小板與內(nèi)皮細胞的黏附作用，表達于血小板、巨核細胞胞質(zhì)[12]。本研究結(jié)果顯示：巨核細胞胞質(zhì)及血小板表面均表達CD36，隨著細胞的成熟，CD36表達越來越高，并可區(qū)分巨核細胞的3個亞型。楊蕾[13]研究顯示：隨著體外培養(yǎng)的巨核細胞成熟、調(diào)亡血小板增加，多倍體巨核細胞的比例下降，提示巨核細胞產(chǎn)血小板的過程也是巨核細胞凋亡的過程。產(chǎn)血小板型是成熟巨核細胞發(fā)揮功能的重要階段，且占整個成熟階段的大段時程。在接近成年時，3類細胞的數(shù)量最終趨于平穩(wěn)，處于相對平衡穩(wěn)定的狀態(tài)。

本實驗顯示脾P13 d產(chǎn)血小板型的數(shù)量明顯下降，可能與肝幼稚血小板和巨核細胞P15 d消失有關(guān)[14]。而肝于P15 d之后的造血能力極弱，脾造血能力逐漸增強，提示脾發(fā)揮造血功能稍晚于肝，與姜曉君等[15]研究結(jié)果相符。早期的脾是類似于紅骨髓樣的造血組織，造血干細胞在此逐漸增殖分化成各類血細胞。對于小鼠來說，脾是其終生的造血器官之一。