張 娜 李 薇 張 聰 張 輝 賈新轉(zhuǎn) 張 軼

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科， 婦產(chǎn)科， 石家莊 050011)

醫(yī)療水平的進(jìn)步使越來越多的年輕腫瘤患者得以長期生存，但與此同時(shí)，放化療會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷女性患者的生育力[1-2]。故對(duì)此類患者生育力的保存受到越來越多的關(guān)注。生育力保存常用3種方式：卵子冷凍、胚胎冷凍、卵巢組織冷凍。與卵子冷凍和胚胎冷凍相比，卵巢組織冷凍不僅可以解決患者將來的生育問題，還能延續(xù)女性內(nèi)分泌功能。目前卵巢組織冷凍常用程序化冷凍和玻璃化冷凍2種方法，本研究分別采用這2種方法對(duì)人的卵巢組織進(jìn)行凍存，然后解凍并移植到裸鼠體內(nèi)，通過比較移植后始基卵泡的完整率及凋亡情況來比較2種冷凍方法的優(yōu)缺點(diǎn)，以期尋找更適合凍存卵巢組織的方法。

1 材料和方法

1.1 人卵巢組織

實(shí)驗(yàn)用人卵巢組織來自于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科2016年4月至2017年3月子宮內(nèi)膜癌手術(shù)患者16例，患者無生育力保存要求，年齡34～40歲，平素月經(jīng)規(guī)律，術(shù)前3個(gè)月無性激素服用史，無化療史及放療史。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

移植宿主為8周齡健康SCID裸鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。選取雌性裸鼠32只，隨機(jī)分為2組：程序化冷凍組16只，移植以慢速程序化方法凍融的人卵巢組織；玻璃化冷凍組16只，移植以玻璃化方法凍融的人卵巢組織。

1.3 主要試劑及材料

乙二醇(ethylene glycol, EG)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、蔗糖購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)購自美國SAGE公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 實(shí)驗(yàn)過程

將術(shù)中切下的卵巢組織置于預(yù)冷的PBS溶液中迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，將卵巢皮質(zhì)切成2 mm×2 mm×2 mm 大小的組織塊，隨機(jī)分為2份，每份6～8塊，其中1份應(yīng)用慢速程序化冷凍方法凍存卵巢組織備用，1份應(yīng)用玻璃化冷凍方法凍存卵巢組織備用。解凍后的卵巢組織一半直接用4%多聚甲醛固定并做成石蠟包塊備用，一半用于移植。32只裸鼠經(jīng)腹部手術(shù)摘取兩側(cè)卵巢，觀察3周后按分組將解凍后的人卵巢組織移植于裸鼠頸后皮下部位，6周后取下移植的人卵巢組織，用4%多聚甲醛固定并做成石蠟包塊備用。

1.5 人卵巢組織的冷凍與復(fù)蘇

1.5.1 慢速程序化冷凍方法 冷凍過程參考Mikkel等[3]的方法，冷凍液和解凍液均采用含10%白蛋白的PBS為基礎(chǔ)液。放入預(yù)先加入1 ml冷凍保護(hù)液(含1.5 mol/L乙二醇、0.1 mol/L蔗糖)的1.8 ml的冷凍瓶中，4℃平衡25 min后放入慢速冷凍儀中，從4℃開始以2℃/min降至-9℃，植冰，保持10 min，然后以0.3℃/min降至-40℃，再以10℃/min降至-140℃，最后直接投入液氮保存。復(fù)蘇時(shí)迅速將冷凍管放入37℃水浴鍋中60～90 s，之后將卵巢組織放入解凍液中(含0.75 mol/L乙二醇、0.25 mol/L蔗糖)10 min，稀釋液中(0.5 mol/L蔗糖)10 min，基礎(chǔ)液中10 min。

1.5.2 玻璃化冷凍及解凍 冷凍過程參考汪翔等[4]的方法，基礎(chǔ)液同慢速程序化冷凍。室溫條件下，放入冷凍液(含7.5%乙二醇，7.5%二甲基亞砜)25 min，然后放入玻璃化液(含15%乙二醇、15%的二甲基亞砜、0.5 mol/L蔗糖)15 min(包括裝入載桿)，后直接投入液氮保存。解凍時(shí)將載桿取出后迅速放入37℃解凍液(含 1 mol/L蔗糖)中3 min，后放入稀釋液(含0.5 mol/L蔗糖)中5 min，基礎(chǔ)液中5 min。

1.6 卵巢組織病理學(xué)觀察

石蠟切片后行常規(guī)H-E染色，于光鏡(400倍)下觀察卵巢組織，根據(jù)Gougeon[5]標(biāo)準(zhǔn)判定始基卵泡：?jiǎn)螌颖馄交虮馄脚c立方混合的前顆粒細(xì)胞包繞初級(jí)卵母細(xì)胞。正常卵泡形態(tài)判定：顆粒細(xì)胞分布均勻，基底膜完整。異常卵泡形態(tài)判定：結(jié)構(gòu)不完整或消失，顆粒細(xì)胞排列不規(guī)則、部分脫落，部分可見卵母細(xì)胞核固縮或皺縮[4]。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：400倍高倍視野下隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)各視野內(nèi)正常始基卵泡數(shù)和全部始基卵泡數(shù)，正常始基卵泡率=正常始基卵泡數(shù)/全部始基卵泡數(shù)×100%。

1.7 卵巢組織凋亡檢測(cè)及結(jié)果判定

應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞呈棕黃色為陽性細(xì)胞，卵母細(xì)胞陽性或50%以上的顆粒細(xì)胞陽性定義為卵泡凋亡。始基卵泡凋亡率=凋亡始基細(xì)胞數(shù)/整張切片始基細(xì)胞總數(shù)×100%[6]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 始基卵泡情況

無論是解凍后還是移植后，始基卵泡正常率2組間相比差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。程序化冷凍組始基卵泡正常率解凍后和移植后相比差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，玻璃化冷凍組始基卵泡正常率移植后明顯低于解凍后(P<0.05)(表1)。

表1 2組卵巢組織中始基卵泡正常率的比較Tab 1 Comparison of the survival rate of primordial follicles in the two groups of ovarian tissues (n=16, %)

*P<0.05vsafter thawing in vitrification

2.2 卵巢組織中始基卵泡凋亡情況

2組相比，解凍后程序化冷凍組的始基卵泡凋亡率明顯低于玻璃化冷凍組(P<0.05)，而在移植后2組的始基卵泡凋亡率無差別(P>0.05)。無論是程序化冷凍組還是玻璃化冷凍組，解凍后和移植后相比，始基卵泡凋亡率亦無差別(P>0.05)(表2，圖1)。

表2 2組卵巢組織始基卵泡凋亡率的比較[個(gè)(%)]Tab 2 The apoptosis rate of primordial follicles in the two groups of ovarian tissues [n(%)]

*P<0.05vsprogrammed freezing after thawing

圖1 卵巢組織經(jīng)冷凍、移植后始基卵泡凋亡情況Fig 1 The apoptosis of primordial follicles after thawing and graft

3 討論

卵巢組織冷凍是一種生育力保存技術(shù)，能否成功主要取決于2點(diǎn)：一是冷凍保存，二是凍融后移植。卵巢組織細(xì)胞不僅數(shù)量多，而且種類多，所以不同于胚胎冷凍，卵巢組織冷凍時(shí)冷凍保護(hù)劑的滲透較弱，對(duì)于不同種類的細(xì)胞滲透性和滲透時(shí)間也不同，所以卵巢組織冷凍尚沒有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方案。而卵巢組織復(fù)蘇移植后的存活情況是決定生殖能力能否恢復(fù)的另一個(gè)關(guān)鍵。影響移植成功的因素有很多，包括移植后的組織所處環(huán)境的溫度、壓力、血供等。

目前卵巢組織冷凍的方法主要有程序化冷凍與玻璃化冷凍2種，這2種冷凍方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。程序化冷凍所需冷凍保護(hù)劑的濃度較低，對(duì)組織和細(xì)胞的直接毒性小，但需昂貴的冷凍設(shè)備且耗時(shí)較長，冷凍時(shí)易產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶致細(xì)胞損傷。玻璃化冷凍不需使用冷凍設(shè)備，耗時(shí)短，但需使用高濃度冷凍保護(hù)劑。卵泡的發(fā)育過程為始基卵泡—初級(jí)卵泡—次級(jí)卵泡—竇前卵泡—竇卵泡，故始基卵泡是各級(jí)卵泡的起源，標(biāo)志著卵巢的儲(chǔ)備功能。因此，卵巢組織冷凍過程中始基卵泡保存完整是成功冷凍的保證。因?yàn)楸狙芯咳寺殉步M織中生長期卵泡極少，所以只統(tǒng)計(jì)始基卵泡。

本研究結(jié)果顯示，無論是程序化冷凍還是玻璃化冷凍，對(duì)卵巢組織中始基卵泡保持形態(tài)正常方面沒有明顯差別。但經(jīng)過玻璃化冷凍后的卵巢組織移植后始基卵泡的再次損傷明顯比經(jīng)過程序化冷凍的要大，而卵巢組織復(fù)蘇移植后的存活情況是決定生殖能力能否恢復(fù)的關(guān)鍵。因此可以認(rèn)為，與程序化冷凍相比，玻璃化冷凍后對(duì)卵巢組織的潛在損傷更大。

自卵巢組織冷凍技術(shù)開展以來，對(duì)于始基卵泡的凋亡是否受到冷凍影響這一問題研究結(jié)果就無達(dá)成一致[4, 6-8]。本研究結(jié)果顯示，程序化冷凍的卵巢組織，其始基卵泡的凋亡率明顯低于玻璃化冷凍，說明程序化冷凍對(duì)卵巢組織的影響更小。但這與姬萌霞等[6]的研究結(jié)果有所不同，該學(xué)者認(rèn)為兩種冷凍方法對(duì)始基卵泡凋亡的影響沒有差別。分析原因可能是因?yàn)槁殉步M織冷凍復(fù)蘇移植過程中的多個(gè)不同環(huán)節(jié)造成，如冷凍時(shí)卵巢組織塊的大小、移植部位、操作人員的技術(shù)水平、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件等。雖然始基卵泡凋亡在女性胎兒時(shí)期便開始出現(xiàn)，并自出生后一直貫穿整個(gè)生育期，但凍融移植后的卵巢組織始基卵泡的凋亡會(huì)不會(huì)影響將來的卵巢內(nèi)分泌功能尚需更長時(shí)間的觀察。

除冷凍本身對(duì)卵巢組織產(chǎn)生損傷外，復(fù)蘇后再移植的恢復(fù)過程中亦可使卵巢組織受到不同的損傷[9-11]。影響移植成功的因素有很多，而移植后的組織由于周圍的溫度、壓力、血供等方面的影響導(dǎo)致組織壞死是最主要的因素。本研究采用了頸部皮下這樣一個(gè)組織結(jié)構(gòu)疏松的移植部位，目的是為了減少對(duì)移植物的壓力，從而進(jìn)一步減少對(duì)移植卵巢組織的損傷。結(jié)果顯示，經(jīng)過兩種冷凍方法冷凍復(fù)蘇后的卵巢組織，在移植后無論是始基卵泡的正常率還是凋亡率，與解凍后相比均未出現(xiàn)差異，說明移植對(duì)卵巢組織存活的影響并不大。因此，將人的卵巢組織移植到裸鼠頸部皮下相對(duì)來說是成功的。

綜上所述，人卵巢組織的冷凍對(duì)始基卵泡的形態(tài)及凋亡均會(huì)產(chǎn)生影響，相比之下，程序化冷凍對(duì)卵巢組織的影響更小。將解凍后的人卵巢組織移植到裸鼠頸部皮下相對(duì)來說是可行的。