，，，　

中國(guó)是僅次于印度和印尼的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，耐多藥肺結(jié)核疫情較為嚴(yán)峻[1]?？敲顾?、阿米卡星及卷曲霉素3種氨基糖苷類藥物是治療耐多藥肺結(jié)核的核心藥物，作用機(jī)制都是與結(jié)核分枝桿菌核糖體結(jié)合，阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)合成。有研究顯示，結(jié)核菌的rrs、tlyA、eis、gidB基因突變與氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)[2]。國(guó)內(nèi)耐多藥結(jié)核分枝桿菌的主要基因型是北京基因型，但是北京基因型是否與耐藥相關(guān)一直存在爭(zhēng)議[3-5]。本研究通過RD105缺失基因檢測(cè)法[6]鑒定寧波地區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因型，并對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因進(jìn)行突變特征分析，為本地區(qū)耐多藥肺結(jié)核的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源用于檢測(cè)的106例耐多藥結(jié)核分枝桿菌臨床分離株來源于寧波地區(qū)11個(gè)縣(市)、區(qū)2014-2016年耐藥監(jiān)測(cè)期間收集的痰培養(yǎng)陽(yáng)性菌株，經(jīng)菌種鑒定及一線抗結(jié)核藥物耐藥檢測(cè)確定為同時(shí)耐異煙肼和利福平的耐多藥臨床分離株。結(jié)核分枝桿菌H37RV標(biāo)準(zhǔn)株來源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心。

1.1.2試劑來源分離培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)基均購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。結(jié)核分枝桿菌DNA提取、PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序相關(guān)試劑及技術(shù)服務(wù)購(gòu)自上海桑尼生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1菌株的分離培養(yǎng)、菌種鑒定按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[7]進(jìn)行。藥物敏感性檢測(cè)采用WHO/IUATLD《耐藥監(jiān)測(cè)指南》推薦的1%比例法對(duì)耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)3種氨基糖苷類藥物的耐藥性檢測(cè)，含藥培養(yǎng)基中藥物終濃度分別為Km 30.0 μg/mL、Am 30.0 μg/mL、Cm 40.0 μg/mL。耐藥百分比=(含藥培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù))×100%，以耐藥百分比大于1%定義為耐藥。

1.2.2結(jié)核分枝桿菌基因組DNA制備取一接種環(huán)L-J培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)良好菌落溶于400 μL TE(PH 8.0)中，震蕩混勻后沸水浴15 min，12 000 g/min離心3 min取上清。

1.2.3北京基因型的鑒定根據(jù)北京基因型菌株RD105片段缺失特點(diǎn)，參照Chen[6]建立的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因PCR擴(kuò)增和測(cè)序根據(jù)結(jié)核分枝桿菌H37RV標(biāo)準(zhǔn)株rrs(GeneID2700429)、tlyA(GeneID885396)、eis(GeneID885903)、gidB(GeneID886243)基因通過Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，見表1。采用20 μL PCR反應(yīng)體系：模板1 μL(50ng)，2×Taq PCR MasterMix 10 μL(TIANGEN)，F(xiàn)orward Primer (20mmol/L) 1 μL，Reverse Primer (20mmol/L) 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30s，57 ℃ 30s，72 ℃ 40 s，30次循環(huán)，72 ℃ 3 min。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Seqman pro 7.1(version 7.1, DNA star Lasergene, Inc. USA)進(jìn)行基因測(cè)序數(shù)據(jù)分析。參比序列為H37RV標(biāo)準(zhǔn)株DNA序列。采用SPSS16.0對(duì)北京基因型和非北京基因型菌株的氨基糖苷類藥物耐藥率、人群分布特征及耐藥基因突變情況進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1耐藥基因引物序列及其擴(kuò)增片段
Tab.1Primer sequence of genes with drug resistance

基因(gene)引物序列(5′—3′)(primersequence)產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp(productlength)擴(kuò)增區(qū)域(position)rrsF1TGGCCGTTTGTTTTGTCAGGR1CCGCACGCTCACAGTTAAG694上游67～627bpF2GTGCCAGCAGCCGCGGTAATR2CCGGCAGTCTCTCACGAGT651506～1156bpF3TGTCGTGAGATGTTGGGTTAR3GCCAACTTTGTTGTCATGC5721063～下游98bptlyAF1AGGCGCACGAGGTGTTGTTGR1AACGACAGGTCGGCCACTACCAGGT528上游57～470bpF2ATGTCGGATACGGCCAGCTGR2ACTTTTTCTACGCGCCGTGC555334～下游81bp表1(續(xù))基因(gene)引物序列(5′—3′)(primersequence)產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp(productlength)擴(kuò)增區(qū)域(position)eisF1GCGTAACGTCACGGCGAAATTCR1GTCAGCTCATGCAAGGTG567上游124～421bpgidBF1CGTAATGTCTCCGATCGAGCR1CTTTGATGGCGAGCATTCG46038～490bp

2　結(jié)　果

2.1不同基因型耐多藥菌株耐藥情況及人群特征分布106株耐多藥結(jié)核分枝桿菌中，有83株78.3%(83/106)屬于北京基因型，有23株21.7%(23/106)屬于非北京基因型。83株北京基因型菌株中，有10株耐氨基糖苷類藥物12.0%(10/83)；23株非北京基因型菌株對(duì)氨基糖苷類藥物全部敏感，見表2。

表2不同基因型耐多藥結(jié)核分枝桿菌氨基糖苷類藥物耐藥情況
Tab.2Distribution of Beijing genotype with second-line injectable drugs resistance among MDR-TB

耐氨基糖苷類藥物種類Drugresistance北京基因型菌株數(shù)Beijinggenotype非北京基因型菌株數(shù)Non?Beijinggenotype耐Km+Am+CmResistanceofkanamy?cin，amikacinandca?preomycin30耐Km+AmResistanceofkanamy?cinandamikacin50耐Km+CmResistanceofkanamy?cinandcapreomycin00耐Am+CmResistanceofamikacinandcapreomycin10單耐KmResistanceofkanamy?cin10單耐AmResistanceofamikacin00單耐CmResistanceofcapreomy?cin00敏感Susceptibleofsecond?lineinjectabledrugs7323合計(jì)Total8323

注 Km：卡那霉素(kanamycin)；Am：阿米卡星(amikacin)；Cm：卷曲霉素(capreomycin)

治療分類在不同基因型耐多藥菌株中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.318,P<0.05)，不同基因型耐多藥菌株人群分布特征，見表3。

表3不同基因型耐多藥結(jié)核分枝桿菌人群分布特征
Tab.3Characteristics of population among MDR-TB

人群特征Characteristicsofpopulation北京基因型(n=83)Beijinggenotype非北京基因型(n=23)Non?Beijinggenotype菌株數(shù)(%)number(%)菌株數(shù)(%)number(%)性別gender男man59(71．1)15(65．2)女woman24(28．9)8(34．8)年齡age<257(8．4)1(4．4)25～36(43．4)7(30．4)45～24(28．9)8((34．8)>6416(19．3)7(30．4)治療分類treatment初治initialtreatment38(45．8)5(21．7)復(fù)治retreatment45(54．2)18(78．3)

2.2氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因突變特征10株耐氨基糖苷類藥物的耐多藥菌株中有4株發(fā)生耐藥相關(guān)基因突變，突變率為40.0%，96株對(duì)氨基糖苷類藥物敏感的耐多藥菌株中有24株發(fā)生耐藥相關(guān)基因突變，突變率為26.7%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.048,P>0.05)，見表4。96株對(duì)氨基糖苷類藥物敏感的耐多藥菌株中有5株發(fā)生rrs基因突變，突變類型為1株A1401G及4株A514C；有12株發(fā)生tlyA基因突變，突變類型均為T708G；有2株發(fā)生eis基因突變，突變類型為1株發(fā)生A10G、C12T、T14A、G15C、T37C多位點(diǎn)聯(lián)合突變，1株發(fā)生A10T、C12T聯(lián)合突變；有5株發(fā)生gidB基因突變，突變類型為4株發(fā)生115位缺失C堿基，1株發(fā)生A208C突變。

表4氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)基因突變特征
Tab.4Characteristics of gene mutations with second-line injectable drugs resistance among MDR-TB

氨基糖苷類藥物耐藥表型second?lineinjectabledrugsresistancerrstlyA耐藥基因突變類型mutationlocieisgidB菌株數(shù)number耐Km+Am+Cm(Resistanceofkanamycin，amikacinandcapreomycin)NNNN3耐Km+Am(Resistanceofkanamycinandamikacin)A1401GNNN3A1401GT708GNN1耐Am+Cm(Resistanceofamikacinandcapreomycin)NNNN1單耐Km(Resistanceofkanamycin)NNNN1氨基糖苷類藥物全敏感(Susceptibletosecond?lineinjectabledrugs)A1401GNNN1A514CNNN4NT708GNN12NNA10G+C12T+T14A+G15C+T37CN1NNA10T+C12TN1NNN115位缺C4NNNA208C1

注 Km：卡那霉素(kanamycin)；Am：阿米卡星(amikacin)；Cm：卷曲霉素(capreomycin)；N：無基因突變

3　討　論

北京基因型結(jié)核分枝桿菌是全球廣泛分布及流行的優(yōu)勢(shì)菌群，且是我國(guó)耐多藥結(jié)核分枝桿菌主要基因型[3-5]目前針對(duì)北京基因型的流行與耐藥結(jié)核病傳播之間關(guān)系的研究存在爭(zhēng)議，有的研究認(rèn)為[8-9]，北京基因型菌株易對(duì)抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥，耐藥因素間接促進(jìn)了該基因型的流行。但部分研究顯示[10-13]，北京基因型與非北京基因型菌株在耐藥性方面無差異。本次研究表明納入研究的耐氨基糖苷類藥物的耐多藥結(jié)核分枝桿菌均為北京基因型，提示北京基因型這一因素可能與本地區(qū)耐多藥菌株對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥有關(guān)。

有研究顯示，編碼16SrRNA的rrs基因突變與氨基糖苷類藥物的耐藥有關(guān)，且rrs基因1401位A-G的突變是氨基糖苷類藥物3種藥物之間交叉耐藥的分子機(jī)制之一[14-15]。本次研究表明，同時(shí)耐卡那霉素與阿米卡星的5株耐多藥菌株中有4株發(fā)生了1401位A-G的突變80.0%(4/5)，在氨基糖苷類藥物敏感的耐多藥菌株中發(fā)生了5株rrs基因突變5.2%(5/96)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.752,P<0.05)，與現(xiàn)有研究相符[16-17]。

gidB基因廣泛存在于細(xì)菌基因組中，其編碼蛋白是一種rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其靶點(diǎn)16S rRNA的G527正常甲基化對(duì)于氨基糖苷類藥物與16S rRNA的穩(wěn)定結(jié)合起到至關(guān)重要的作用。Okamoto[18]研究發(fā)現(xiàn)gidB基因突變會(huì)導(dǎo)致16S rRNA的530環(huán)不能得到修飾而引起氨基糖苷類藥物耐藥。gidB基因突變類型較為多樣，存在點(diǎn)突變，缺失，插入等[19-20]。本研究顯示，耐氨基糖苷類藥物的耐多藥結(jié)核分枝桿菌未發(fā)生gidB基因突變，相反在對(duì)氨基糖苷類藥物敏感的菌株中存在gidB基因缺失和點(diǎn)突變情況。因此，gidB基因突變與氨基糖苷類藥物的耐藥關(guān)系值得商榷。同時(shí)由于gidB基因突變與低水平的鏈霉素耐藥有關(guān)[21]，gidB基因突變的這部分菌株可能存在低水平的鏈霉素耐藥。

結(jié)核分枝桿菌增強(qiáng)胞內(nèi)存活基因(enhanced invracellular survival,eis)及其編碼蛋白EIS(乙酰轉(zhuǎn)移酶家族成員)可增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力。有研究顯示，eis基因啟動(dòng)子區(qū)域突變與氨基糖苷類藥物低水平耐藥有關(guān)[2]。本次研究結(jié)果顯示，耐氨基糖苷類藥物的耐多藥結(jié)核分枝桿菌中未發(fā)生eis基因啟動(dòng)子區(qū)域突變，相反在對(duì)氨基糖苷類藥物敏感的耐多藥菌株中有發(fā)生突變，提示eis基因啟動(dòng)子區(qū)域突變與氨基糖苷類藥物耐藥之間關(guān)系尚不明確。

tlyA基因的開放閱讀框(ORF)內(nèi)包含一個(gè)具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的功能基團(tuán)，在結(jié)核分枝桿菌rRNA甲基化過程中起到促進(jìn)rRNA成熟，促進(jìn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的作用。有研究顯示，該基因發(fā)生斷裂、缺失或突變，則細(xì)菌會(huì)對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，且結(jié)核分枝桿菌該基因突變主要為點(diǎn)突變[22-23]。本研究表明，耐氨基糖苷類藥物的菌株中僅有一株發(fā)生tlyA基因突變，且是和rrs基因的聯(lián)合突變，在對(duì)氨基糖苷類藥物敏感的菌株中卻有12株發(fā)生了tlyA基因突變，提示tlyA基因突變與氨基糖苷類藥物的耐藥性關(guān)系無特異性。

綜上所述，寧波地區(qū)MDR-TB中北京基因型與氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)，目前已知的耐藥相關(guān)基因突變不能完全解釋結(jié)核分枝桿菌對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥的原因，有關(guān)分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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