葉志華　黃耿　桂定文

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤，其發(fā)病率在泌尿生殖系統(tǒng)中僅次于膀胱癌，位居第二[1]。腎透明細胞癌是腎癌病理分型中最常見的類型[2]。腎癌一般起病隱匿，早期無特異性癥狀，故而患者確診時易出現(xiàn)局部浸潤或向遠處轉(zhuǎn)移。近年來，腎癌的治療方法日趨成熟，早期腫瘤經(jīng)手術治療后效果良好，但對已發(fā)生局部或遠處轉(zhuǎn)移的腫瘤在聯(lián)合放化療或免疫治療后療效仍不理想。因此,對腎癌侵襲和轉(zhuǎn)移機制的分子水平研究仍有十分重要的意義。高遷移率族蛋白A2 (high mobility group proteins 2，HMGA2)是目前已在多個系統(tǒng)中證實與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的癌基因[3-4]，其在腎癌中的作用鮮有文獻報道。本研究通過RNA干擾技術，抑制HMGA2 基因在腎癌細胞系786-O中的表達，觀察并探討其對786-O細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人腎癌細胞系786-O購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。使用RPMI 1640培養(yǎng)液，內(nèi)含10%胎牛血清、50 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素。細胞于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，換液間隔為2～3 d一次。于細胞對數(shù)生長期實驗。siRNA由武漢bioscience公司設計并合成，序列為：正義鏈 5′-UCCGACUGCCCAAGGCACUUUCAAU-3′，反義鏈 5′-AUUGAAAGCCUUGGGCAGUCGGA-3′；陰性對照組(NC組)使用陰性對照 siRNA，序列為：正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反義鏈 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′，堿基順序采用隨機生成，與人類基因外顯子無同源性。將5×105數(shù)量的786-O細胞接種于6孔板中，待細胞生長密度約80%左右時，使用lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。實驗分為空白對照組(Ctrl組，未使用siRNA及轉(zhuǎn)染試劑)、NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)及siHMGA2組(轉(zhuǎn)染HMGA2 siRNA)。

二、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)

HMGA2上、下游引物分別為5′-CACCTCATCTCCCGAAAGGT-3′、5′-GTTGGTTCTTGCTGCTGCTT-3′；內(nèi)參-肌動蛋白(β-actin)上、下游引物分別為5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTF-3′、5′-GGGCACGAAGGCTCATCATr-3′。于細胞轉(zhuǎn)染48 h后，分別提取各組細胞總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈，反轉(zhuǎn)錄后PCR反應條件：92 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。分析結(jié)果以HMGA2與β-actin的灰度相對值表示。

三、Western免疫印跡

細胞轉(zhuǎn)染 48 h 后，分別收集各組細胞，然后加入含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA 裂解液，裂解 30 min 后進行超聲勻漿并提取細胞總蛋白。用 BCA 法檢測總蛋白濃度后沸水浴變性蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE) 電泳，再將凝膠置于電轉(zhuǎn)槽中進行電轉(zhuǎn)，最后凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5% 脫脂牛奶封閉 2 h后，分別加入相應一抗HMGA2 1∶200(ab97276; Abcam, Cambridge, UK)；鈣粘蛋白E (E-Cadherin) 1∶500 (#14472, CST, USA)；波形蛋白(Vimentin) 1∶200(#5471, CST, USA)，4 ℃孵育過夜，同時以GAPDH為內(nèi)參。室溫下孵育膜 2 h，PBST 緩沖液洗膜 3 次，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗在室溫下孵育膜 1 h，PBST 洗膜 3 次，暗室中滴加 ECL 底物顯色，膠片記錄陽性條帶表達，后用gel pro 4.0 軟件對膠片掃描的圖像進行分析。以各目的蛋白與相應內(nèi)參條帶的灰度值比值進行統(tǒng)計學分析。

四、劃痕實驗

于細胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用無胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，用20 μl槍頭形成劃痕，洗去脫落細胞。顯微鏡下拍照并記錄劃痕寬度。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后再次顯微鏡下拍照并記錄劃痕寬度。依細胞愈合相對距離判斷細胞運動能力。

五、Transwell細胞侵襲實驗

Matrigel膠與無血清培養(yǎng)液按1∶8稀釋后向Transwell小室內(nèi)加入50 μl稀釋過的Matrigel膠，于超凈臺中風干過夜。Transwell上室加入用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液重懸的轉(zhuǎn)染48 h后的786-O細胞200 μl (含5×104個細胞)，下室加入400 μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后吸去室內(nèi)液體，用棉棒擦去微孔膜上室面的細胞，多聚甲醛固定30 min，于37 ℃恒溫箱中結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗2次。在200倍光鏡下隨機選取5個視野進行觀察，計數(shù)每個視野的細胞數(shù)目，以遷移細胞的相對數(shù)目來表示腫瘤細胞的遷移能力。每組取其平均值，并進行統(tǒng)計分析。實驗重復3次。

六、統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，應用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件分析，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

一、HMGA2 siRNA抑制786-O細胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表達

RT-PCR結(jié)果顯示siHMGA2組HMGA2 mRNA水平較Ctrl組和NC組明顯降低，Western免疫印跡結(jié)果提示siHMGA2組HMGA2蛋白表達較Ctrl組和NC組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

二、HMGA2 siRNA對786-O細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關蛋白表達的影響

Western免疫印跡結(jié)果顯示siHMGA2組E-Cadherin水平較Ctrl組及NC組明顯升高，Vimentin水平較Ctrl及NC組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Ctrl組與NC組之間無顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明siHMGA2可明顯抑制786-O細胞EMT水平(圖2)。

A：E-Cadherin；B：Vimentin

圖1786-O細胞中HMGA2蛋白和mRNA的表達水平(與Ctrl組、NC組相比較*P<0.05)

A:E-Cadherin；B：Vimentin

圖2HMGA2 siRNA對786-O細胞中EMT相關蛋白表達的影響(與Ctrl組、NC組比較*P<0.05)

三、抑制HMGA2對786-O細胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示siHMGA2組細胞遷移能力較Ctrl組明顯減弱，表明siHMGA2顯著降低了786-O細胞的遷移能力(圖3)。

圖3Ctrl組及siHMGA2組786-O細胞的遷移能力

四、抑制HMGA2對786-O細胞侵襲能力的影響

Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果顯示siHMGA2組細胞侵襲能力[(82.000±5.202)個]較Ctrl組[(202.000±3.610)個]、NC組[(189.000±6.433)個]明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

A:Ctrl組；B：NC組；C：siHMGA2組

圖4siHMGA2對不同組786-O細胞侵襲能力的影響(×200)

討　　論

腎癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，因其起病隱匿，早期無特異性癥狀，患者初診發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的比例約為30%[5]。腎癌的病理分型有透明細胞癌、嗜色細胞癌、嫌色細胞癌、集合管癌以及未分類腎細胞癌，其中透明細胞癌約占80%。腎癌的治療方式目前以手術治療為主，但患者術后復發(fā)率仍高約30%[6]。由于腎癌細胞對放療及化療均不敏感，深入研究腎癌發(fā)生發(fā)展過程中分子作用的機制可為腎癌的臨床治療提供新的基因靶點及治療方式。

HMGA是一組存在于真核生物細胞核內(nèi)，可與染色質(zhì)結(jié)合的非組蛋白，包括HMGA、HMGB及HMGN三個家族，其中HMGA2屬HMGA家族之一[7]。HMGA2包含3個AT-hook結(jié)構(gòu)域和1個酸性C末端，其可通過AT-hook與DNA鏈結(jié)合導致DNA拉伸、彎曲或成環(huán)，故又被稱為結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄因子[8]。HMGA2可通過調(diào)節(jié)多種基因的表達參與細胞增殖、分化及腫瘤形成等生理過程[3]。在甲狀腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)HMGA2的異常表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[9-12]。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學特征[13]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移主要包含以下主要過程：腫瘤細胞的脫落、黏附、細胞外基質(zhì)的降解、腫瘤細胞的移動以及血管形成[14]。其中腫瘤細胞的脫落與EMT密切相關。EMT是指上皮細胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細胞表型的生物學過程，在腫瘤形成的過程中主要表現(xiàn)為：上皮細胞失去極性，細胞間的黏附和緊密連接減少，細胞獲得游走遷移能力并逐漸轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細胞形態(tài)和特性的細胞[15-16]。近年來已有多項研究表明，HMGA2異常表達增高對腫瘤EMT發(fā)生有明顯的促進作用：Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)HMGA2過表達可通過EMT通路促進舌癌轉(zhuǎn)移；Wei等[18]研究報道上調(diào)HMGA2可促進子宮內(nèi)膜癌細胞EMT發(fā)生；Xia等[19]研究證實HMGA2參與了鼻咽癌細胞EMT形成且HMGA2高表達提示患者預后不良。

本研究中，我們根據(jù)HMGA2的基因序列，設計并合成了siRNA-HMGA2，并經(jīng)體外轉(zhuǎn)染腎癌細胞系786-O獲得了HMGA2敲除細胞系，通過檢測EMT相關蛋白的表達水平及劃痕實驗，探討抑制HMGA2對腎癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。研究結(jié)果顯示siHMGA2轉(zhuǎn)染組細胞的HMGA2表達明顯降低，遷移能力明顯減弱，E-Cadherin表達明顯升高而Vimentin表達明顯降低，表明siHMGA2可明顯降低786-O細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

本實驗因條件限制，未能對HMGA2過表達情況下腎癌細胞EMT表型結(jié)果及侵襲轉(zhuǎn)移能力進行比較研究，HMGA2調(diào)控腎癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子信號通路有待后續(xù)研究補充。綜上所述，抑制HMGA2 對腎癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力有明顯抑制作用，HMGA2具有作為預測腎癌發(fā)展及腎癌基因治療靶標的潛能。

[1]Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]Thomas JS, Kabbinavar F. Metastatic clear cell renal cell carcinoma: A review of current therapies and novel immunotherapies[J]. Crit Rev Oncol Hematol,2015,96(3):527-533.

[3]Sun J, Sun B, Sun R, et al. HMGA2 promotes vasculogenic mimicry and tumor aggressiveness by upregulating Twist1 in gastric carcinoma[J]. Sci Rep,2017,7(1):2229.

[4]Sun J, Sun B, Zhu D, et al. HMGA2 regulates CD44 expression to promote gastric cancer cell motility and sphere formation[J]. Am J Cancer Res,2017,7(2):260-274.

[5]Bedke J, Gauler T, Grunwald V, et al. Systemic therapy in metastatic renal cell carcinoma[J]. World J Urol,2017,35(2):179-188.

[6]Rini BI, Campbell SC, Escudier B. Renal cell carcinoma[J]. Lancet,2009,373(9669):1119-1132.

[7]Liu Y, Fu QZ, Pu L, et al. HMGA2 Expression in Renal Carcinoma and its Clinical Significance[J]. J Med Biochem,2015,34(3):338-343.

[8]Gao X, Dai M, Li Q, et al. HMGA2 regulates lung cancer proliferation and metastasis[J]. Thorac Cancer,2017,8(5):501-510.

[9]Wu ZY, Wang SM, Chen ZH, et al. MiR-204 regulates HMGA2 expression and inhibits cell proliferation in human thyroid cancer[J]. Cancer Biomark,2015,15(5):535-542.

[10]Eide HA, Halvorsen AR, Bjaanaes MM, et al. The MYCN-HMGA2-CDKN2A pathway in non-small cell lung carcinoma--differences in histological subtypes[J]. BMC Cancer,2016,16:71.

[11]Li W, Wang Z, Zha L, et al. HMGA2 regulates epithelial-mesenchymal transition and the acquisition of tumor stem cell properties through TWIST1 in gastric cancer[J]. Oncol Rep,2017,37(1):185-192.

[12]Shi Z, Li X, Wu D, et al. Silencing of HMGA2 suppresses cellular proliferation, migration, invasion, and epithelial-mesenchymal transition in bladder cancer[J]. Tumour Biol,2016,37(6):7515-7523.

[13]Park S, Yeung ML, Beach S, et al. RKIP downregulates B-Raf kinase activity in melanoma cancer cells[J]. Oncogene,2005,24(21):3535-3540.

[14]Ljungberg B, Campbell SC, Choi HY, et al. The epidemiology of renal cell carcinoma[J]. Eur Urol,2011,60(4):615-621.

[15]Wu Y, Zhou BP. New insights of epithelial-mesenchymal transition in cancer metastasis[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2008,40(7):643-650.

[16] Hammond SM, Sharpless NE. HMGA2, microRNAs, and stem cell aging[J]. Cell,2008,135(6):1013-1016.

[17]Zhao XP, Zhang H, Jiao JY, et al. Overexpression of HMGA2 promotes tongue cancer metastasis through EMT pathway[J]. J Transl Med,2016,14:26.

[18]Wei L, Liu X, Zhang W, et al. Overexpression and oncogenic function of HMGA2 in endometrial serous carcinogenesis[J]. Am J Cancer Res,2016,6(2):249-259.

[19]Xia YY, Yin L, Tian H, et al. HMGA2 is associated with epithelial-mesenchymal transition and can predict poor prognosis in nasopharyngeal carcinoma[J]. Onco Targets Ther,2015,8:169-176.