陳小龍　肖躍海　孫發(fā)

腎細(xì)胞癌作為人類最常見的惡性腫瘤之一，其在成人惡性腫瘤中約占2%～3%，平均每年全球超過30萬人被確診，發(fā)病率大約以2%的速度遞增[1]。它起源于近曲小管上皮細(xì)胞，較易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其發(fā)病由環(huán)境變化因素和遺傳物質(zhì)的異常共同決定[2]。目前對于早期腎癌的治療主要是通過外科手術(shù)的方式，但早期診斷十分困難，約33%的腎癌患者在首診時(shí)就有轉(zhuǎn)移，40%的局限性腎癌最后也會(huì)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。轉(zhuǎn)移性腎癌患者的預(yù)后較差，其5年生存率多數(shù)低于10%[4]。因此揭示腎癌潛在的致瘤機(jī)制而進(jìn)行早期診斷顯得尤為關(guān)鍵。最新研究發(fā)現(xiàn)，基因的表觀遺傳調(diào)控在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起主導(dǎo)作用[5]。關(guān)于腎癌的發(fā)病機(jī)制、早期診斷和預(yù)后等方面的DNA甲基化研究越來越受到重視，本文對DNA甲基化與腎癌之間的關(guān)系以及抑癌基因甲基化在腎癌中的相關(guān)研究做一綜述。

一、DNA甲基化與腎癌之間的關(guān)系

在過去15年中，大多數(shù)研究集中在確定CpG島或啟動(dòng)子區(qū)域與基因沉默的相互關(guān)系而發(fā)生的變化。但是許多其他基因組區(qū)域也具有特異性(組織特異性)或異常(腫瘤)甲基化[6-7]。這里我們將介紹腎癌特異性CpG甲基化與基因沉默之間的具體關(guān)系。

1.啟動(dòng)子甲基化：通過在CpG島甲基化中發(fā)現(xiàn)減少的基因組，因而建立了第一種腫瘤特異性表觀遺傳學(xué)異?，F(xiàn)象的機(jī)制，表明所有CpG島低甲基化可能會(huì)誘導(dǎo)腫瘤的基因組的不穩(wěn)定狀態(tài)，這將造成腫瘤基因經(jīng)歷進(jìn)化選擇性應(yīng)激，從而導(dǎo)致啟動(dòng)子的高甲基化和抑癌基因的沉默。RB1即是通過這種機(jī)制確定的第一個(gè)沉默基因[8]。癌癥中許多關(guān)鍵的腫瘤抑制基因(如CDKN2A、RASSF1A、MLH1、CDH1等)會(huì)被啟動(dòng)子甲基化失活。研究表明，腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)和乳頭狀腎細(xì)胞癌(papillary renal cell carcinoma，pRCC)中CpG島甲基化的比例分別高達(dá)31%[9]和7%[10]。存在CpG島表型(CpG island methylator phenotype, CIMP)的組織大多數(shù)具有腫瘤侵襲和糖酵解活性，因此CIMP的pRCC和晚期低生存率密切相關(guān)。特定區(qū)域的甲基化取決于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)、DNMT3a和DNMT3b，它們通常在癌癥中過表達(dá)。這些酶與相關(guān)的CpG結(jié)合蛋白(如MBD2、MBD3和MeCP2)一起將組蛋白脫乙酰酶和其他組蛋白修飾的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至基因的啟動(dòng)子區(qū)域，從而誘導(dǎo)組蛋白3,4的脫乙?；源龠M(jìn)染色質(zhì)凝聚、基因沉默。

5-甲基胞嘧啶可被氧化成由TET家族成員(TET1、TET2和TET3)催化的5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxylmethylcytosine, 5hmC)。許多特異性組織聚集了大量的5hmC，表明它不僅參與基因表達(dá)的調(diào)控，而且也可能是一種特異性的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記。與癌旁組織相比，ccRCC組織中5hmC基因組水平顯著降低[1]。除了作為ccRCC診斷的重要生物標(biāo)志物外，5hmC聚集表明它在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中也起重要作用[12]。然而，5hmC的缺失、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其在腎癌中的確切機(jī)制和功能尚不清楚。

2.頻繁異常調(diào)節(jié)通路：WNT-β連環(huán)蛋白和MET信號通路。

兩種類型的抑制蛋白調(diào)節(jié)WNT信號通路：一種與WNT產(chǎn)生的分泌型卷曲相關(guān)蛋白(secreted frizzled-related protein, SFRP)直接結(jié)合，并阻止其與FZ結(jié)合；另一種是Dickkopf相關(guān)蛋白(Dickkopf-related proteins, DKK)，其結(jié)合WNT受體復(fù)合物L(fēng)RP-5和LRP-6，是重要的組成部分。此外，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(insulin-like growth factor-binding proteins, IGFBP)1,2,4,6也會(huì)通過WNT途徑阻斷LRP-5、LRP-6和FZ的活性。作為WNT途徑的下游靶點(diǎn)，β-連環(huán)蛋白促進(jìn)致瘤性蛋白(原癌基因c-MYC、細(xì)胞周期蛋白D1等)的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖和組織浸潤。研究表明，β-連環(huán)蛋白的降解是VHL抑制蛋白的關(guān)鍵缺氧誘導(dǎo)因子之一[13]。由于關(guān)鍵途徑的把控基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化的緣故，WNT/β-連環(huán)蛋白信號通路常常被中斷，并且不穩(wěn)定β-連環(huán)蛋白的活化可導(dǎo)致腎細(xì)胞的腫瘤發(fā)生[14]。據(jù)報(bào)道，在腎細(xì)胞癌中，通過激活WNT通路中一些抑癌基因啟動(dòng)子甲基化可最終破壞β-連環(huán)蛋白的正常修飾[5]。研究表明，腎細(xì)胞癌中SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5、WIF1、DKK1、DKK2、DKK3的甲基化頻率分別為47%、53%、53%、57%、73%、44%、58%、50%，并且蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制也將導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白的積累及其相應(yīng)的靶基因上調(diào)[15]。Ibanez等[16]檢測20例ccRCC和10例pRCC的甲基化頻率分別為35%和20%，而IGFBP1也出現(xiàn)沉默。

MET(也稱為HGF受體)是調(diào)節(jié)某些關(guān)鍵致瘤過程的重要受體，例如通過PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAFMET途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和代謝。研究表明，MET中的突變與遺傳性和散發(fā)性pRCC密切相關(guān)，但在散發(fā)性ccRCC中很少見[17]。SPINT2編碼Kunitz型蛋白酶抑制劑2，其通過抑制HGF介導(dǎo)MET活化。有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)SPINT2在64例ccRCC和38例pRCC中的甲基化頻率分別為30%和45%，這些研究表明在腎細(xì)胞癌中MET介導(dǎo)的信號往往受到干擾[18]。

EMT與細(xì)胞黏附：腎細(xì)胞癌中的VHL抑制蛋白有利于保持CDH1的表達(dá)，而CDH1編碼降鈣素E具有維持腎上皮形態(tài)的作用。降鈣素E水平降低既可增加致瘤性，又能促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)作用[19]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，由于CDH1啟動(dòng)子的甲基化，ccRCC和pRCC中降鈣素E發(fā)生沉默現(xiàn)象[10,15]。編碼纖維蛋白原2的原纖維蛋白2(fibrillin-2,FBN2)基因通常在腎細(xì)胞癌中發(fā)生甲基化，體內(nèi)FBN2表達(dá)的喪失與腎細(xì)胞癌的致瘤性密切相關(guān)。來自癌癥基因組圖譜的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BN2是腎細(xì)胞癌中常見的表觀遺傳標(biāo)記，200例患者中有34%被檢測到該基因甲基化，3%的患者出現(xiàn)FBN2突變[20]。有研究表明，原鈣黏蛋白8(protocadherin 8, PCDH8)是鈣粘蛋白家族的第2個(gè)成員，在ccRCC中不僅會(huì)通過啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)表達(dá)沉默，而且其表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物與患者生存相關(guān)[20-21]。

雖然PCDH8的功能尚未闡明，但越來越多的研究證據(jù)表明，這種黏附分子在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附和表觀遺傳表型的維持中起重要作用，而4個(gè)膠原蛋白家族成員COL1A1、COL1A2、COL14A1、COL15A1還通過腎細(xì)胞癌中的啟動(dòng)子甲基化表現(xiàn)出基因下調(diào)或沉默[15-16，22-23]，作為賴氨酸氧化酶同源物L(fēng)OXL1基因在48例ccRCC中的作用大約1/3表現(xiàn)出類似現(xiàn)象[23]，但這些蛋白質(zhì)的缺失與腎細(xì)胞癌的發(fā)展有何種關(guān)系尚不清楚。然而可明確的是細(xì)胞外基質(zhì)重塑過程是致瘤性和發(fā)生轉(zhuǎn)移的中心環(huán)節(jié)。

除了上述信號傳導(dǎo)通路改變外，還存在著其他因基因甲基化而沉默的信號傳導(dǎo)通路，如APAF1、BNC1、CASP8、CDKN2A、FHIT、GREM1、MGMT、TU3A、UCHL1等[9-10，15，20]。但是對于這些基因所編碼蛋白質(zhì)的缺失與腎癌發(fā)生、發(fā)展是否有關(guān)，目前尚不清楚。

3.非啟動(dòng)子DNA甲基化：大多數(shù)甲基化分析主要針對直接起始轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的啟動(dòng)子區(qū)CpG甲基化。然而，該項(xiàng)目的大規(guī)模全基因組分析表明，遠(yuǎn)程調(diào)控增強(qiáng)子也會(huì)產(chǎn)生CpG甲基化。在基因組水平分析腎細(xì)胞癌中增強(qiáng)子甲基化，可發(fā)現(xiàn)異常增強(qiáng)子甲基化的富集與缺氧細(xì)胞的活性相關(guān)[24]。該研究還發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)子甲基化與預(yù)后顯著相關(guān)。目前，增強(qiáng)子元件的改進(jìn)映射及DNA甲基化新型微陣列(包括這些區(qū)域的探針)等技術(shù)的研究，進(jìn)一步拓展了非啟動(dòng)子DNA甲基化方面的研究途徑。

二、抑癌基因甲基化與腎細(xì)胞癌的研究

1.腎細(xì)胞癌的經(jīng)典抑癌基因甲基化研究：①VHL基因：VHL是腎癌中抑癌基因的典型代表，編碼213個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)pVHL。因此其失活會(huì)導(dǎo)致pVHL合成障礙。值得注意的是，作為多功能蛋白質(zhì)，pVHL與家族性和散發(fā)性腎細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，這與其在泛素化過程中的作用有關(guān)。此外，由于體細(xì)胞突變或啟動(dòng)子甲基化，pVHL在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)異常是非常多見的。據(jù)報(bào)道，VHR缺陷的ccRCC細(xì)胞系顯示出加速細(xì)胞凋亡和異常細(xì)胞周期等特征。當(dāng)pVHL表達(dá)正常時(shí)細(xì)胞系恢復(fù)初始生長，說明其在細(xì)胞周期調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[25]。Yang等[26]研究團(tuán)隊(duì)通過薈萃分析，在1 998例腎細(xì)胞癌患者和294例對照組中發(fā)現(xiàn)在固定效應(yīng)模型下，596例腎細(xì)胞癌和294例非惡性樣本顯示VHL啟動(dòng)子甲基化明顯高于對照組。這項(xiàng)研究表明，VHL啟動(dòng)子甲基化可能在腎細(xì)胞癌的發(fā)生中起重要作用，并且與腎細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。然而，VHL啟動(dòng)子高甲基化與特定的臨床病理特征無關(guān)。最近的研究也發(fā)現(xiàn)VHL突變或甲基化狀態(tài)是病程較差患者的重要指標(biāo)，而對腎細(xì)胞癌預(yù)后判斷評估并無明顯價(jià)值[27]。②p16：p16基因由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成，由于其產(chǎn)物p16蛋白與CDK4結(jié)合發(fā)生失活可明顯抑制細(xì)胞的分裂與增殖，所以p16基因在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中失活。p16未發(fā)生基因突變時(shí)，p16 5'CpG島再次甲基化與其完全失活相關(guān)。Maestro等[28]通過對40例散發(fā)性腎癌患者的研究發(fā)現(xiàn)p16甲基化發(fā)生率為20%，并且其甲基化主要集中在腎癌發(fā)生的早期。與此同時(shí)，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在60例腎癌患者中p16 CpG島甲基化率約占73.3%[29]，表明p16基因的突變?nèi)笔Ш图谆c腎癌病理分級、臨床分期呈正相關(guān)，該研究還表明其甲基化發(fā)生在腎癌發(fā)展的早期階段。因此p16可能作為早期診斷腎癌的潛在表觀遺傳標(biāo)志物之一。③APC基因：APC基因包含15個(gè)外顯子，該基因啟動(dòng)子區(qū)因過度甲基化而在部分腫瘤組織中呈現(xiàn)出表達(dá)異常的狀態(tài)。作為WNT信號傳導(dǎo)通路中重要的抑癌基因之一，APC基因失活可誘導(dǎo)β連環(huán)蛋白降解發(fā)生障礙，致使細(xì)胞發(fā)生惡變。Hauser等[30]發(fā)現(xiàn)APC的高甲基化與晚期腫瘤分期相關(guān)。然而治療癌癥的關(guān)鍵在于腫瘤的早期診斷，Skrypkina等[31]研究發(fā)現(xiàn)APC甲基化可能有助于腎癌的早期診斷，在27例腎癌和15例健康對照樣本中APC甲基化頻率分別為51.9%和6.7%，表明APC基因CpG島甲基化可作為癌癥無創(chuàng)診斷標(biāo)志物之一。然而，APC作為單細(xì)胞基因分析對腎細(xì)胞癌的診斷敏感性仍較低，研究報(bào)告顯示35例腎細(xì)胞癌患者APC甲基化頻率和靈敏度均為54.3%，多個(gè)基因(包括APC、PTGS2和GSTP1)診斷靈敏度提高到62.9%[30]。因此，APC不僅在腎細(xì)胞癌的發(fā)展和進(jìn)展中起著重要的作用，而且在早期診斷中作為非侵入性診斷標(biāo)記同樣扮演著十分重要的角色。

2.腎細(xì)胞癌的新近發(fā)現(xiàn)抑癌基因甲基化：①GPX3基因：位于5q23的GPX3基因是腫瘤中常見的染色體雜合缺失位點(diǎn)?；蚓幋a的蛋白質(zhì)是谷胱甘肽過氧化物酶3，GPXs是唯一已知的細(xì)胞外糖基化酶，并且被氧化損傷。因此，GPX3基因的失活可能破壞細(xì)胞對內(nèi)、外源性遺傳毒性ROS的清除作用。GPX3能夠催化分解過氧化物，從而破壞細(xì)胞的防御能力誘發(fā)基因突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前GPX3已被確定為許多癌癥中的腫瘤抑制因子。據(jù)報(bào)道,在6株ccRCC細(xì)胞系中的5株中檢測到GPX3甲基化及下調(diào)現(xiàn)象，并且ccRCC中的GPX3 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著低于相鄰的非惡性腎臟組織[32]。結(jié)果表明，GPX3甲基化狀態(tài)和高級別腫瘤具有顯著相關(guān)性。因此，ccRCC中GPX3啟動(dòng)子頻繁發(fā)生高甲基化導(dǎo)致其失活，可能作為腎腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素，而且GPX3腫瘤特異性甲基化還可作為ccRCC早期檢測和判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物。②CHD5基因：CHD5位于1號染色體的短臂3區(qū)6帶3亞帶(1 p36.3)，是CHD染色質(zhì)重塑蛋白(CHD1～CHD9)家族的第5個(gè)成員。CHD5不但擁有由染色質(zhì)結(jié)合域、鋅指結(jié)構(gòu)域、解旋酶樣域、ATP結(jié)合域等重要的組件，還具有功能未知的其他結(jié)構(gòu)域。CHD5染色質(zhì)域和解旋酶樣域與染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的形成密不可分，可依賴于TAP提供能量而使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生調(diào)整，因此其具有染色質(zhì)重構(gòu)功能。研究顯示在小鼠中，由于p19 arf和p53的上調(diào)，CHD5作為劑量依賴性TSG可抑制MDM2(人同源HDM2)途徑進(jìn)而降解p53，從而上調(diào)p53蛋白水平，促使細(xì)胞增殖、凋亡和衰老，最終抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展[33]。癌癥基因組數(shù)據(jù)庫中CHD5甲基化在腎細(xì)胞癌組的總頻率為49%(334/688)，其中ccRCC最高(100%，320/320)，其次為pRCC(4.1%，12/292)和嫌色腎細(xì)胞癌(3%，2/66)[34]。Du等[35]研究發(fā)現(xiàn)CHD5在多數(shù)正常的泌尿系器官組織(包括腎臟)中廣泛表達(dá)，但在9株腎細(xì)胞癌細(xì)胞系和55例原發(fā)性腫瘤中的甲基化頻率分別是78%和44%，其表達(dá)通過啟動(dòng)子CpG甲基化常常出現(xiàn)沉默或下調(diào)現(xiàn)象。此外，該研究還證明CHD5作為腎細(xì)胞癌的新型TSG，主要通過原發(fā)性腫瘤中的啟動(dòng)子甲基化而發(fā)生失活。③其他相關(guān)抑癌基因：近年來，隨著DNA甲基化備受關(guān)注，研究了許多抑癌基因的異常甲基化位點(diǎn)并得到相關(guān)基因甲基化譜，見表1。包括MSH2、GREM-1、BTG3、DKK1、KILLIN、TCF21、FHIT、RIZ1、ADAMTS18、ECRG4、ASC/TMS1和SEMA3B等[36-43]，盡管這些基因甲基化在腎癌中的作用逐漸得到認(rèn)識(shí)，但是針對它們的研究大多數(shù)在少量臨床樣本中進(jìn)行，缺乏大型臨床證據(jù)的支持，因此多數(shù)作用機(jī)制并未得到闡明，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

表1　腎細(xì)胞癌相關(guān)基因甲基化表達(dá)譜

三、結(jié)論

綜上所述，DNA甲基化生物標(biāo)志物的檢測可作為鑒別腎臟腫瘤良惡性的手段之一，其具有較高的靈敏度和特異性。這些生物標(biāo)志物可用于腎癌患者的早期診斷，同時(shí)DNA甲基化在腎癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，在臨床上亦可作為對腎癌患者治療后復(fù)發(fā)監(jiān)測的指標(biāo)。

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