王禮平　盧曉明　陽(yáng)東榮　李蘭　王進(jìn)峰　周?chē)?guó)洋　尹九湖　劉亞?wèn)|　董彬彬

尿路上皮癌是最常見(jiàn)的膀胱癌之一，其在膀胱癌中占90%以上，具有術(shù)后復(fù)發(fā)率高、復(fù)發(fā)后惡性程度增加的特點(diǎn)[1]。Survivin作為凋亡抑制蛋白家族抑制作用最強(qiáng)的成員之一，表達(dá)于包括膀胱癌在內(nèi)的絕大多數(shù)惡性腫瘤，主要作用于細(xì)胞有絲分裂G2/M期，在細(xì)胞中發(fā)揮著促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用[2]。Vol'pina等[3]對(duì)膀胱癌術(shù)后標(biāo)本分析顯示，膀胱癌組織中Survivin表達(dá)較周?chē)＝M織顯著增高，且與分化程度和臨床分期呈正相關(guān)。Diakos等[4]及本課題既往研究[5]均發(fā)現(xiàn)上調(diào)miRNA-494的表達(dá)能夠有效抑制Survivin蛋白表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究應(yīng)用生物學(xué)軟件TargetScan 5.2預(yù)測(cè)microRNA-494與Survivin mRNA配對(duì)情況，成功構(gòu)建腺病毒載體Ad-pre-microRNA-494[6-7]，將其作用于膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞，觀察其對(duì)Survivin的抑制作用及對(duì)膀胱癌細(xì)胞的影響。

材料與方法

一、材料

1.細(xì)胞株及腺病毒載體：應(yīng)用生物學(xué)軟件Target Scan 5.2對(duì)miRNA-494基因與Survivin mRNA進(jìn)行匹配評(píng)分(圖1)，RT-PCR法調(diào)取目的基因，將其連接線(xiàn)性化后的穿梭質(zhì)粒載體，聯(lián)合骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞同源重組后產(chǎn)生重組腺病毒載體，構(gòu)建成功后測(cè)序并檢測(cè)保存(圖2)[5]，人膀胱尿路上皮癌UM-UC-3細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection, ATCC)，HEK-293A細(xì)胞株購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

圖1miRNA-494與Survivin基因數(shù)據(jù)庫(kù)匹配結(jié)果

圖2腺病毒質(zhì)粒陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果

2.主要器材及試劑：胎牛血清、Ham's F12及RPMI-1640培養(yǎng)液均購(gòu)自Gibco公司，逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV購(gòu)自Fermentas公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司；Real-time PCR試劑盒SYBR FAST Qpcr Kit Master Mix(2×) Universal購(gòu)自KAPA Biosystems公司；PI kit、Annexin Ⅴ-APC/7-AAD kit購(gòu)自Abnova公司；Braford蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，兔抗人Survivin單克隆抗體購(gòu)自CST公司、Rabbit anti-GAPDH 多克隆抗體購(gòu)自EarthOx公司、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：UM-UC-3細(xì)胞使用添加了10%胎牛血清的Ham's F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)、HEK-293A細(xì)胞使用添加了10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境均為含5% CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)溫箱。

2.重組腺病毒的擴(kuò)增、純化及滴度測(cè)定：取出保存的Ad-pre-microRNA-494腺病毒載體及空病毒載體置入37 ℃、5% CO2水箱中復(fù)蘇，將病毒原液離心后按每100 μl原液感染5×106個(gè)HEK-293A細(xì)胞的比例進(jìn)行接種，熒光顯微鏡檢測(cè)綠色熒光表達(dá)，待70%～80%細(xì)胞漂浮后收集離心并置入EP管，于-70 ℃冰箱保存。氯化銫離心純化后按稀釋法進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。測(cè)定好的腺病毒感染UM-UC-3細(xì)胞：實(shí)驗(yàn)分為PBS、空腺病毒載體(簡(jiǎn)稱(chēng)Ad)、Ad-pre-microRNA-494(簡(jiǎn)稱(chēng)Ad-494)3組，使用Ad以50、100、200 MOI劑量感染UM-UC-3細(xì)胞48 h，光鏡及熒光視野下分別觀察感染了50、100、200 MOI劑量Ad的細(xì)胞情況，可見(jiàn)200 MOI感染的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞漂浮、圓縮的病毒毒性作用；其余劑量組細(xì)胞與PBS對(duì)照組相比無(wú)顯著差別，熒光視野觀察幾乎所有細(xì)胞均呈現(xiàn)綠色熒光，表明50、100 MOI感染劑量的Ad對(duì)細(xì)胞毒性作用極小，且感染效率高達(dá)95%以上(圖3)。我們遵照選擇感染效率高、毒性低的原則，選擇50 MOI作為最優(yōu)劑量。

A：光鏡觀，×100；B：熒光鏡觀，×100

圖3腺病毒在293細(xì)胞中成功擴(kuò)增(光鏡、熒光鏡)

3.MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞生長(zhǎng)情況：使用50 MOI感染各組細(xì)胞，MTT法檢測(cè)24、48、72 h的細(xì)胞生長(zhǎng)情況，紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度(OD)值，并繪制成細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

4.RT-PCR法檢測(cè)Survivin mRNA表達(dá)情況：將感染腺病毒后24、48、72 h的細(xì)胞加入Trizol進(jìn)行總mRNA提取，Promega試劑盒進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：70 ℃ 5 min，37 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，-70 ℃ 10 min。

PCR引物序列(對(duì)照內(nèi)參GAPDH)：Survivin-F 5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3′；Survivin-R 5′-GCTCCGGCCAGAGGCTCAA-3′。

反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 52 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 54 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果。

5.Western blot法檢測(cè)Survivin蛋白表達(dá)：收集各時(shí)間段細(xì)胞蛋白后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)實(shí)行蛋白定量，孵育并洗膜，柯達(dá)膠片曝光、顯影、定影，進(jìn)行條帶光密度值檢測(cè)(Bio-Rad Quantity One軟件)。

6.細(xì)胞周期阻滯及凋亡檢測(cè)：收集腺病毒感染后24、48、72 h的各組細(xì)胞約4×106個(gè)，PBS清洗后去除上清液，經(jīng)PI、Annexin Ⅴ-APC/7-AAD單染色及雙染色后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期、凋亡率檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)　　果

腺病毒復(fù)蘇、擴(kuò)增、純化成功，稀釋法滴度檢測(cè)結(jié)果為5×108GFU/ml。

由細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)來(lái)看(圖4)，Ad-494組相對(duì)于Ad組、PBS組對(duì)細(xì)胞存在生長(zhǎng)抑制作用，以72 h時(shí)間段作用最為明顯。

圖4不同時(shí)間段各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

RT-PCR法檢測(cè)Survivin mRNA表達(dá)，如圖5所示，相比對(duì)照組，Ad-494組24、48、72 h后Survivin mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴(lài)性(P<0.05)。

Western blot法檢測(cè)Survivin蛋白表達(dá)，結(jié)果(圖6)表明Ad-494組對(duì)Survivin蛋白表達(dá)有顯著抑制作用；通過(guò)灰度分析軟件分析顯示，與Ad組相比，Ad-494組24、48、72 h后Survivin蛋白表達(dá)分別為(23.14±3.21)%、(16.32±3.68)%、(11.46±2.25)%。

圖5各組不同時(shí)間段Survivin mRNA表達(dá)情況

圖6各組不同時(shí)間段Survivin蛋白表達(dá)情況

使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯及凋亡情況，PI單染色后流式細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，重組腺病毒感染后的細(xì)胞均呈現(xiàn)G2/M期阻滯，24、48、72 h結(jié)果分別為(21.26±3.12)%、(44.21±3.42)%、(53.31±3.78)%，顯著高于PBS組[分別為(5.32±1.21)%、(5.47±1.32)%、(6.44±1.12)%]、Ad組[分別為(7.11±1.44)%、(7.82±1.26)%、(9.11±1.63)%](P<0.05)。進(jìn)行Annexin Ⅴ-APC/7-AAD雙染色后，各組細(xì)胞在72 h的凋亡率最高，分別為PBS組(3.29±2.24)%、Ad組(8.23±2.24)%、Ad-494組(24.42±4.45)%(P<0.05)(圖7)。

圖7各組感染72 h后細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)情況

討　　論

膀胱癌是常見(jiàn)的泌尿生殖系腫瘤之一，據(jù)Chen等[8]統(tǒng)計(jì)，2015年中國(guó)約有80 500例新發(fā)膀胱癌被確診，32 900例膀胱癌患者死亡。其中90%以上為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，即便進(jìn)行規(guī)范的治療，仍有50%～70%的患者可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。

微小RNA(miRNA)是通過(guò)結(jié)合mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)產(chǎn)生基因沉默效應(yīng)的一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA分子。既往的大量研究顯示，異常表達(dá)的miRNAs與許多類(lèi)型的腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且超過(guò)一半的miRNAs通過(guò)作用于腫瘤基因組區(qū)域發(fā)揮作用，某些miRNA作為標(biāo)志物甚至可以追溯到腫瘤的起源組織，為明確腫瘤的發(fā)生提供依據(jù)[9-10]。一部分高度表達(dá)的miRNAs通過(guò)抑制腫瘤抑制因子起癌基因的作用，另一部分則可以負(fù)向調(diào)節(jié)癌基因，發(fā)揮腫瘤抑制因子作用。miRNAs通過(guò)影響一系列調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮作用，單個(gè)miRNA甚至可以通過(guò)多個(gè)途徑影響更多基因表達(dá)，調(diào)節(jié)一系列腫瘤相關(guān)基因。Survivin作為經(jīng)典的凋亡抑制蛋白分子之一，幾乎在所有常見(jiàn)的惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，并且表達(dá)Survivin 蛋白的腫瘤大多預(yù)后較差，腫瘤細(xì)胞凋亡率低[11]。其通過(guò)發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞分裂和抑制細(xì)胞凋亡的雙重作用，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，基于上述特征也使其成為了腫瘤基因治療的理想靶點(diǎn)[12]。Zhang等[13]近期研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA-542-3p可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)Survivin從而抑制膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖，Yang等[14]則發(fā)現(xiàn)miR-138-5p可通過(guò)靶向膀胱癌細(xì)胞中的Survivin蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)檢測(cè)尿液標(biāo)本中Survivin的表達(dá)水平可以為膀胱腫瘤的早期診斷提供重要的依據(jù)[15]。Jeon等[16]進(jìn)行的一項(xiàng)包含2 165例膀胱癌患者的薈萃分析顯示，Survivin蛋白高表達(dá)的患者預(yù)后更差。因此，本課題組通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)miRNA-494的腺病毒載體，靶向抑制膀胱腫瘤細(xì)胞中Survivin基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可能是一種較好的基因治療方式。

本研究應(yīng)用已成功構(gòu)建的腺病毒載體Ad-pre-microRNA-494，靶向抑制膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞，觀察其不同時(shí)間段對(duì)Survivin的抑制作用及對(duì)細(xì)胞周期、凋亡情況的影響，檢測(cè)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)腺病毒載體Ad-pre-miRNA-494在體外能顯著抑制Survivin表達(dá)，抑制膀胱癌UM-UC-3細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其凋亡，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性，為miRNA介導(dǎo)的膀胱癌基因治療提供了有益的嘗試。

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