宋章興　崔應(yīng)東　饒雪飛

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是中老年男性中第二常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。據(jù)報(bào)道，每10萬(wàn)人中就有128人罹患PCa，全球每年有110萬(wàn)新診斷的PCa，且每年有超過(guò)3萬(wàn)人死于PCa[1-3]。此外，隨著人口的老年化和診斷技術(shù)的提高，PCa的發(fā)病率逐年上升[4]。雖然局限性PCa一般發(fā)展比較緩慢，但其容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是骨轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)。有研究表明PCa的骨轉(zhuǎn)移率高達(dá)90%，一旦PCa發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或骨轉(zhuǎn)移，患者的臨床預(yù)后則極差[5]。目前對(duì)于前列腺的相關(guān)檢查手段主要包括直腸指診、經(jīng)直腸超聲、血清前列腺特異性抗原(prostate specific antigen, PSA)檢測(cè)及前列腺穿刺活檢[3,5-7]。直腸指診和經(jīng)直腸超聲檢查主要與檢查者的經(jīng)驗(yàn)有關(guān)，其主觀性比較強(qiáng)；血清PSA檢測(cè)雖然可以重復(fù)進(jìn)行，但是PSA水平容易受到其他因素的影響，其特異性不高；前列腺穿刺活檢屬有創(chuàng)檢查，且有一定的假陰性率。因此，亟待開(kāi)發(fā)出新的檢測(cè)手段，對(duì)于PCa的早期診斷和精準(zhǔn)治療具有重要的意義。

胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TYMS)在嘧啶代謝中發(fā)揮著重要作用，是DNA合成的關(guān)鍵酶[8]。有報(bào)道認(rèn)為其與體內(nèi)多種腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[9-12]，然而目前尚未有報(bào)道其與PCa的發(fā)病及進(jìn)展之間的關(guān)系。因此，本研究通過(guò)分析TYMS基因表達(dá)與PCa的關(guān)系，以期為PCa的早期診斷和治療提供參考。

對(duì)象與方法

一、研究材料及方法

GEO(gene expression omnibus)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫(kù)是由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)建設(shè)并維護(hù)的基因表達(dá)譜儲(chǔ)存數(shù)據(jù)庫(kù)，截止2018年2月該數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)收集4 348 項(xiàng)數(shù)據(jù)集共2 397 211例樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，我們從中下載4項(xiàng)獨(dú)立的PCa基因表達(dá)數(shù)據(jù)集GSE32448[13]、GSE16560[14]、GSE17951[15-16]以及GSE79957[17]進(jìn)行相關(guān)分析。GSE32448包含40例PCa患者的臨床樣本和40正常前列腺組織的臨床樣本，我們利用該數(shù)據(jù)集比較TYMS基因在PCa組織中和正常前列腺組織中的表達(dá)差異；GSE16560包含了281例PCa患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，同時(shí)還附帶對(duì)應(yīng)PCa患者的臨床病史特點(diǎn)數(shù)據(jù)(包括患者的發(fā)病年齡、Gleason評(píng)分及隨訪時(shí)間等)，我們利用該數(shù)據(jù)集分析TYMS基因表達(dá)高低與PCa患者的發(fā)病年齡及總生存期的相關(guān)性。GSE79957包含了260例PCa患者臨床樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，同樣也包含比較詳細(xì)的PCa患者臨床病史數(shù)據(jù)(包括患者的發(fā)病年齡、TNM分期及PSA水平等)，我們利用該數(shù)據(jù)集分析TYMS基因表達(dá)與PCa患者TNM分期及血清PSA水平的相關(guān)性；GSE17951包含了154例PCa患者臨床樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，我們利用該數(shù)據(jù)集進(jìn)行基于TYMS基因表達(dá)水平的基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)，以明確TYMS對(duì)PCa可能的作用機(jī)制。

二、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

TYMS在PCa和正常前列腺組織中的表達(dá)水平采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)，并采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析正常前列腺組織和PCa組織中TYMS基因表達(dá)差異。以TYMS在GSE16560和GSE79957中表達(dá)水平的中位數(shù)將PCa患者臨床樣本分為T(mén)YMS高表達(dá)組和TYMS低表達(dá)組。使用卡方檢驗(yàn)分析TYMS高表達(dá)組和TYMS低表達(dá)組PCa患者臨床病理特點(diǎn)的差異。采用Log-rank法對(duì)TYMS高表達(dá)組和TYMS低表達(dá)組PCa患者進(jìn)行生存分析。以上所有統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0軟件完成，P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的判別依據(jù)。采用GraphPad 5.0作為繪圖工具。此外，我們采用GSEA2-2.2.4[18-19]進(jìn)行GSEA分析，以hallmark 基因集作為參考基因集，置換次數(shù)為1 000次，以P<0.05、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates, FDR)<0.25作為顯著性富集的篩選依據(jù)。

結(jié)　　果

一、TYMS在正常前列腺組織和PCa組織中的表達(dá)情況

TYMS在GSE32448中所對(duì)應(yīng)的探針為1554696_s_at。如圖1所示，正常前列腺組織中TYMS的表達(dá)水平明顯低于PCa組織中的表達(dá)水平[(16.04±9.54)vs(45.57±91.07)，P<0.044 8]。

圖1正常前列腺組織和PCa組織中TYMS表達(dá)水平

二、TYMS表達(dá)與PCa患者臨床病理相關(guān)性分析

為了進(jìn)一步探討TYMS表達(dá)水平與PCa的發(fā)病、進(jìn)展之間的關(guān)系，我們分析了PCa患者的年齡、Gleason評(píng)分、TNM分期、血清PSA水平在TYMS高表達(dá)組和TYMS低表達(dá)組中的分布差異。如表1所示，TYMS高表達(dá)組和TYMS低表達(dá)組患者在年齡和血清PSA水平分布上無(wú)明顯差異。TYMS低表達(dá)組中Gleason評(píng)分為6的患者數(shù)目明顯高于TYMS高表達(dá)組(P<0.000 1)，TYMS高表達(dá)組中腫瘤分期T3的患者數(shù)明顯多于TYMS低表達(dá)組(P=0.002)。

表1　TYMS基因表達(dá)水平與PCa患者臨床病理特征的相關(guān)性

﹡TYMS高表達(dá)患者中有3例未報(bào)道患者TNM分期

三、TYMS對(duì)PCa患者預(yù)后的影響

為了進(jìn)一步明確TYMS與PCa患者總生存期的關(guān)系，我們分析了GSE16560數(shù)據(jù)集中TYMS高表達(dá)組(n=140)和TYMS低表達(dá)組(n=141)患者的總生存期。如圖2所示，TYMS低表達(dá)組PCa患者總生存期明顯優(yōu)于TYMS高表達(dá)組(P=0.005 6)。

四、基于TYMS基因高表達(dá)的GSEA分析

為了推測(cè)TYMS影響PCa患者臨床預(yù)后可能的作用機(jī)制，我們以hallmark基因集為參考基因集，對(duì)TYMS進(jìn)行GSEA分析，結(jié)果如表2所示，TYMS高表達(dá)組PCa樣本主要富集了E2F信號(hào)通路、MYC通路、有絲分裂紡錘體、DNA修復(fù)、G2M檢查點(diǎn)以及糖酵解等生物學(xué)過(guò)程，提示TYMS可能通過(guò)以上信號(hào)通路或分子生物學(xué)過(guò)程影響PCa細(xì)胞的增殖。

圖2TYMS基因低表達(dá)組患者總生存期明顯優(yōu)于TYMS高表達(dá)組患者

表2　基于TYMS基因高表達(dá)組PCa樣本的GSEA分析

討　　論

PCa是歐美國(guó)家男性患者最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，占男性患者癌癥相關(guān)死亡的第二位[1]。雖然以PSA為基礎(chǔ)的早期診斷明顯改善了PCa患者的生存期，但是對(duì)于PCa過(guò)度診斷和過(guò)度治療也隨之上升，進(jìn)而限制了血清PSA檢測(cè)在臨床上的應(yīng)用價(jià)值[6-7]。另一方面，一旦PCa發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的中位生存期則不到5年；去勢(shì)抵抗的PCa患者的中位生存期則不到2年[3]。因此，尋找特異性更高的PCa早期診斷方法具有重要意義。

本研究表明，PCa組織中TYMS的表達(dá)水平明顯高于正常前列腺組織中的表達(dá)水平。低表達(dá)TYMS的PCa患者Gleason評(píng)分和TNM分期明顯優(yōu)于高表達(dá)TYMS的PCa患者。同時(shí)低表達(dá)TYMS的PCa患者的總生存期明顯優(yōu)于高表達(dá)TYMS的PCa患者，提示TYMS與PCa患者的不良臨床特點(diǎn)密切相關(guān)。此外，TYMS高表達(dá)組和TYMS低表達(dá)組患者血清PSA表達(dá)水平無(wú)明顯差異，這可能與PSA檢測(cè)的特異性不高有關(guān)。

有多篇研究報(bào)道TYMS基因能夠影響體內(nèi)多種腫瘤細(xì)胞的增殖。王明等[9]研究表明TYMS基因低表達(dá)與直腸癌患者近期療效具有明顯的相關(guān)性，TYMS低表達(dá)的直腸癌患者放療敏感性更高。Weekes等[10]的研究表明攜帶有TYMS基因突變的胰腺癌患者化療過(guò)程中不良反應(yīng)更少。俞永康等[11]的研究表明ERCC1、TYMS、TUBB3、RRM1和TOP2A是影響食管鱗癌臨床病理特征的部分關(guān)鍵基因。羅春英等[12]的研究表明低表達(dá)TYMS基因的非小細(xì)胞肺癌患者化療反應(yīng)更好、生存期更長(zhǎng)。這些研究與我們的結(jié)論是相似的，即TYMS低表達(dá)的PCa患者臨床病理特點(diǎn)更好，其生存期也更長(zhǎng)。

GSEA分析結(jié)果表明，TYMS可能通過(guò)多種信號(hào)通路(E2F、MYC)、細(xì)胞周期(有絲分裂、G2M檢查點(diǎn))以及細(xì)胞代謝(糖酵解)等途徑影響PCa細(xì)胞的增殖。

綜上所述，TYMS在PCa患者中的表達(dá)水平明顯高于正常前列腺組織，低表達(dá)TYMS的PCa患者在T分期、Gleason評(píng)分方面優(yōu)于TYMS高表達(dá)的PCa患者，同時(shí)低表達(dá)TYMS基因的PCa患者總生存期長(zhǎng)于高表達(dá)TYMS基因的PCa患者。以上結(jié)果提示TYMS可能是PCa患者獨(dú)立的不良預(yù)后因素。

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