王文龍，趙學(xué)亮，孫　柯，馮陳晨，白麗艷，王姝懿,3，王夢(mèng)雅，劉春霞

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)綜合疾病預(yù)防控制中心，呼和浩特 010018; 4. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特010018)

駱駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)(Parabronemaskrjabini)屬于旋尾目，副柔屬[1-2]，是一種寄生在駱駝、牛、羊等反芻動(dòng)物真胃引起疾病的寄生蟲(chóng)，其中駱駝是其最適宜的終末宿主[3-4]。當(dāng)駱駝大量感染斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致腹瀉、生長(zhǎng)遲緩，真胃黏膜潰瘍、出血，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致貧血死亡。國(guó)內(nèi)自楊曉野[5]最早發(fā)現(xiàn)斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病以來(lái)，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)已廣泛存在，并且在不同地區(qū)的感染率為72%～100%。據(jù)報(bào)道，內(nèi)蒙古地區(qū)雙峰駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)感染率高達(dá)100%，感染強(qiáng)度最高可達(dá)7 611條[6]。目前，斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病仍然嚴(yán)重危害我國(guó)牧區(qū)駱駝的健康，制約著當(dāng)?shù)仞B(yǎng)駝業(yè)的發(fā)展，給農(nóng)牧民造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

由于駱駝主要分布在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國(guó)家或地區(qū)，導(dǎo)致斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病的相關(guān)研究資料較少，尤其是駱駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病致病作用的資料極度缺乏。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于駱駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病的研究主要在于形態(tài)學(xué)鑒定、流行病學(xué)調(diào)查等方面[7]，尚無(wú)有效疫苗用于該病的預(yù)防，也未見(jiàn)報(bào)道該病有效的生前診斷方法。目前，在生產(chǎn)實(shí)踐中，往往是在沒(méi)有診斷依據(jù)的情況下盲目給藥驅(qū)蟲(chóng)，不僅造成經(jīng)濟(jì)損失，而且也會(huì)導(dǎo)致藥物殘留超標(biāo)和耐藥蟲(chóng)株的產(chǎn)生。因此，對(duì)該病的研究應(yīng)致力于在探索斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病生物學(xué)特征的基礎(chǔ)上，尋找有效的生前診斷方法和制定新的防治措施。

本試驗(yàn)選取駱駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)為研究對(duì)象，參考已報(bào)道的線(xiàn)蟲(chóng)免疫學(xué)診斷抗原的特點(diǎn)，在斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的基礎(chǔ)上[8-9]，篩選出與斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)免疫相關(guān)的基因，通過(guò)Blastx比對(duì)確定駱駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)免疫相關(guān)基因CTPK(CAMK/TSSK protein kinase)。通過(guò)克隆斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)CTPK基因的CDS區(qū)，利用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及抗原表位等進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，以期找到優(yōu)勢(shì)抗原表位，為駱駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病生前診斷方法iELISA的建立和DNA疫苗的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

1.1.1蟲(chóng)體和質(zhì)粒駱駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)樣本采自于巴彥淖爾市烏拉特后旗雙峰駝?wù)嫖浮Ｔ隗w視鏡下根據(jù)蟲(chóng)體不同形態(tài)特征鑒定雌雄后分裝到2 mL凍存管中，標(biāo)記后放入液氮中由本實(shí)驗(yàn)室保存，用于RNA的提取。

試驗(yàn)所用菌株：E.coliDH5α，北京全式金(TransGen Biotech)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒載體：克隆載體pMD19-T simple vector，大連寶生物工程有限公司。

1.1.2主要試劑與儀器Trizol 通用型RNA快速提取試劑盒、高保真酶Prime STAR?GXL DNA Polymerase、標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自AXYGEN公司，DEPC處理水。NanoDROP核酸濃度測(cè)定儀，ND2000美國(guó)Thermo公司；凝膠影像儀，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司等。

1.2　CTPK的擴(kuò)增

1.2.1總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄按照Trizol[10]抽提總RNA說(shuō)明書(shū)，提取斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)總RNA。將獲得的總RNA進(jìn)行濃度、純度檢測(cè)后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.2.2目的基因的擴(kuò)增CTPK序列來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室駱駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列，應(yīng)用Primer5.0和Oligo6.24軟件設(shè)計(jì)引物，同時(shí)在引物序列中加入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和XhoⅠ，并由華大基因有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增的DNA片段約為519 bp。引物序列，上游引物：5′-GCAGAATTCATGTCCACAAAGACCAC-3′(下劃線(xiàn)為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物：5′-CCACTCGAGACCGTTTTGTTGCACG-3′(下劃線(xiàn)為XhoⅠ酶切位點(diǎn))。以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50 μL：cDNA 4 μL；Up-Primer 1 μL；Down-Primer 1 μL；Prime Star GXL DNA Polymerase 2 μL；5×Prime Star GXL Buffer(Mg2+plus) 10 μL；dNTP Mixture 4 μL；ddH2O 補(bǔ)齊至 50 μL。PCR擴(kuò)增條件： 95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min，共31個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3　CTPK基因的克隆和測(cè)序

將PCR產(chǎn)物目的片段按照Axygen DNA膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收，利用寶生物公司的DNA A-Tailing Kit對(duì)CTPK基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行平末端DNA片段的3′末端加一個(gè)“A-尾”，從而提高了平末端DNA片段的TA克隆效率。具體步驟：10×A-Tailing Buffer 5 μL；dNTP Mixture 4 μL；A-Tailing Enzyme 0.5 μL；平末端DNA片段0.5～5 μg；補(bǔ)ddH2O至50 μL；緩慢混勻后，72 ℃反應(yīng)20 min；在冰浴中靜置2 min。然后按照pMD19-T說(shuō)明書(shū)，將加尾后的PCR產(chǎn)物與克隆載體 pMD19-T 16 ℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中：將100 μL 感受態(tài)細(xì)胞放入冰盒中融化，加入過(guò)夜連接產(chǎn)物10 μL，混勻后冰浴30 min，42 ℃水浴45 s，冰浴2 min，然后加入無(wú)抗性L(fǎng)B培養(yǎng)液500 μL，37 ℃ 190 r·min-1搖菌2～3 h，最后取100 μL涂布在氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落放入含有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌一段時(shí)間后，觀察菌液渾濁程度，如有渾濁可進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性菌株送華大基因公司進(jìn)行雙向序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pMD19T-CTPK。

1.4　CTPK基因生物信息學(xué)分析

使用DNAStar中的EditSeq推導(dǎo)斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)CTPK基因的氨基酸序列，然后利用Prot-Param在線(xiàn)軟件分析CTPK蛋白的氨基酸序列組成和理化性質(zhì)；利用ProtScale軟件分析氨基酸殘基的親疏水性；利用TMHMM Server和SignaIP 4.1 Server[11]分析工具預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)及信號(hào)肽；利用SOPMA在線(xiàn)軟件分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；根據(jù)在線(xiàn)軟件Phyre2.0[12]預(yù)測(cè)CTPK蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用NetPhos3.0 Server軟件預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)；運(yùn)用SecretomeP軟件預(yù)測(cè)非典型分泌蛋白；利用DNAStar分析CTPK蛋白質(zhì)表面可行性，B細(xì)胞、T細(xì)胞抗原表位等[13]。

2　結(jié)　果

2.1　目的基因的PCR擴(kuò)增

以cDNA為模板擴(kuò)增CTPK基因，目的片段為519 bp，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期目的基因片段大小一致(圖1)。

M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1～4. CTPK基因擴(kuò)增產(chǎn)物M. DNA marker DL2000;1-4. Products of CTPK gene圖1　CTPK基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PCR amplification of CTPK gene

2.2　CTPK基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1CTPK基因序列分析與測(cè)定利用NCBI中的ORF Finder工具，對(duì)CTPK基因cDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因cDNA序列全長(zhǎng)共519 bp，含有一個(gè)編碼173個(gè)氨基酸的完整ORF。重組基因測(cè)序后序列與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列相似性為98.46%，發(fā)現(xiàn)8個(gè)突變位點(diǎn)：C139T、G165A、C189T、G199A、A213G、G321A、A348T、G408A。利用在線(xiàn)軟件Rare Codon Caltor對(duì)斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)重組基因測(cè)序序列和轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行稀有密碼子分析，發(fā)現(xiàn)是同義突變，且突變前后稀有密碼子種類(lèi)、數(shù)量沒(méi)有改變。

2.2.2CTPK蛋白理化性質(zhì)分析使用Port-Param在線(xiàn)軟件分析CTPK蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明CTPK蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為20.264 ku，理論等電點(diǎn)(theoretical PI)為9.53，原子總數(shù)共2 831個(gè)，分子式(Formula)為C895H1403N263O264S6，包含20種氨基酸，其中含量最高的是Lys(占8.7%)，含量最低的是Trp占0.6%；帶正電荷數(shù)(Arg+Lys)為27個(gè)，帶負(fù)電荷數(shù)(Asp+Glu)為16個(gè)；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)為53.22，說(shuō)明該蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定蛋白(注：不穩(wěn)定系數(shù)小于40，說(shuō)明是穩(wěn)定蛋白，反之則是不穩(wěn)定蛋白)；脂肪系數(shù)(Aliphatic index)為64.74；總平均親水指數(shù)(Grand average of hydropathicity)為-0.925，說(shuō)明該蛋白質(zhì)是親水性蛋白；假定所有的半胱氨酸都形成二硫鍵，CTPK在280 nm處的摩爾消光系數(shù)為23 630 (mol·cm)，在0.1%(=1 g·L-1)溶液中的摩爾消光系數(shù)為1.154；而當(dāng)所有的二硫鍵打開(kāi)時(shí)280 nm處摩爾消光系數(shù)為23 380 (mol·cm)，在0.1%(=1 g·L-1)溶液中摩爾消光系數(shù)1.517。當(dāng)成熟肽N端的1個(gè)氨基酸為Met時(shí)，CTPK蛋白在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀紅細(xì)胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，在大腸埃希菌體內(nèi)的半衰期大于10 h。

2.2.3CTPK蛋白疏水性/親水性預(yù)測(cè)分析氨基酸殘基根據(jù)其親疏水性可分為親水性氨基酸和疏水性氨基酸。親水性氨基酸位于蛋白質(zhì)的表面，連續(xù)在一起形成抗原表位，同時(shí)也是判斷B細(xì)胞抗原表位的主要參數(shù)[14]。而疏水性氨基酸位于蛋白內(nèi)部。應(yīng)用ProtScale在線(xiàn)軟件對(duì)斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)CTPK基因編碼蛋白親水性/疏水性進(jìn)行分析(圖2)。由輸出的文本可知其疏水性在143～144位點(diǎn)有最大值2.222，在27位點(diǎn)有最小值-3.267。根據(jù)氨基酸分值越高疏水性越強(qiáng)或氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)的規(guī)律分析得出，CTPK基因編碼蛋白多肽鏈大部分區(qū)域分值為負(fù)值，說(shuō)明該蛋白質(zhì)是親水性蛋白，與Port-Param預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

2.2.4CTPK蛋白跨膜區(qū)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)膜蛋白是鑲嵌在生物膜中的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞中起著至關(guān)重要的作用，它們構(gòu)成了各種激素、受體和神經(jīng)信號(hào)，同時(shí)也是離子跨膜的通道。應(yīng)用TMHMM預(yù)測(cè)CTPK蛋白無(wú)跨膜區(qū)，不是跨膜蛋白，且整個(gè)蛋白全部位于膜外(圖3)，跨膜區(qū)中的氨基酸期望值約為0.176(該數(shù)值大于18時(shí)表明有跨膜區(qū))。

圖2　CTPK蛋白疏水性預(yù)測(cè)Fig.2　Prediction of hydrophobicity of CTPK protein

信號(hào)肽是由蛋白質(zhì)N端15～30個(gè)氨基酸殘基組成的一段疏水肽段，決定蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的最終定位。信號(hào)肽不但決定蛋白質(zhì)是否為分泌蛋白，而且與新生肽鏈在細(xì)胞內(nèi)全方位定位有關(guān)。應(yīng)用在線(xiàn)軟件SignalP對(duì)CTPK蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，綜合圖形和輸出文本分析發(fā)現(xiàn)CTPK不存在信號(hào)肽(圖4)，但是在運(yùn)用SecretomeP軟件預(yù)測(cè)非典型分泌蛋白發(fā)現(xiàn)，NN-Score=0.912(若NN-Score>0.5，判定為非典型分泌蛋白)，所以該蛋白質(zhì)屬于分泌蛋白。

圖3　CTPK 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3　Prediction of CTPK protein transmembarne domain

圖4　CTPK 蛋白信號(hào)肽序列預(yù)測(cè)Fig.4　Prediction of signal peptide sequence of CTPK protein

2.2.5CTPK蛋白磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)磷酸化是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，與蛋白質(zhì)的功能密切相關(guān)，蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化為真核細(xì)胞提供了調(diào)節(jié)機(jī)制。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，對(duì)磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)和發(fā)現(xiàn)已成為生物信息學(xué)焦點(diǎn)問(wèn)題之一。通過(guò)在線(xiàn)軟件NetPhos2.0 Server預(yù)測(cè)CTPK蛋白磷酸化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)(圖5)，當(dāng)潛在磷酸化位點(diǎn)的閾值為0.5時(shí)，CTPK蛋白存在24個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中包括10個(gè)絲氨酸位點(diǎn)，11個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)，3個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。

圖5　CTPK蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.5　Prediction of CTPK protein phosphorylation sites

2.2.6CTPK蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò)在線(xiàn)軟件SOPMA對(duì)斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)CTPK基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，可見(jiàn)CTPK蛋白中參與α螺旋形成的氨基酸有34個(gè)，占19.65%；參與β轉(zhuǎn)角形成的氨基酸有25個(gè)，占14.45%；參與延伸鏈形成的氨基酸有32個(gè)，占18.50%；參與無(wú)規(guī)則卷曲形成的氨基酸為82個(gè)，占47.40%。

2.2.7CTPK蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)應(yīng)用在線(xiàn)軟件 Phyre2.0 對(duì)CTPK蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明：CTPK蛋白由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲組合形成超二級(jí)結(jié)構(gòu)，經(jīng)折疊、彎曲等一系列復(fù)雜的過(guò)程形成了CTPK蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)。

圖6　CTPK三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig.6　Prediction of tertiary structure of CTPK

2.2.8CTPK蛋白抗原表位的分析利用DNAStar軟件對(duì)CTPK蛋白抗原表位進(jìn)行分析，由圖7可知其親水性位點(diǎn)主要在1—69、72—74、78—81、84—95、99—103、113—138、158—162、170—173位氨基酸處，與之前ProtScale預(yù)測(cè)的結(jié)果相符。根據(jù)Plot-Emini方法預(yù)測(cè)其表面可行性(圖8)，在1—16、19—33、36—60、67—68、82—85、89—91、101—104、111—121、128—137、159—162、171—173位的氨基酸處有較高的可行性。根據(jù)Jameson-Wolf 方法預(yù)測(cè)CTPK蛋白的抗原性系數(shù)，該蛋白質(zhì)含有較多潛在的B細(xì)胞抗原表位(圖9)，主要位于1—63、67—73、82—96、98—99、101—107、111—126、133—140、148—151、158—164、171—173位氨基酸殘基或其附近，提示這些區(qū)段含有潛在優(yōu)勢(shì)抗原表位。然后再結(jié)合蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性和表面可能性，綜合分析CTPK蛋白潛在的蛋白抗原表位，在1—60、82—95、111—126、133—137、158—162、171—173等位氨基酸殘基區(qū)域β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)較多、親水性和表面可能性指數(shù)較高，暴露于表面的概率較大，提示作為B細(xì)胞抗原表位的可能性較大。T細(xì)胞表位是可以被TCR識(shí)別的抗原表位。應(yīng)用Rothbard-Tayloy方法預(yù)測(cè)含有特定基序(motif)的潛在T淋巴細(xì)胞抗原表位，利用AMPHI方法預(yù)測(cè)免疫優(yōu)勢(shì)輔助性T淋巴細(xì)胞抗原位點(diǎn)，綜合兩種方法預(yù)測(cè)T細(xì)胞抗原表位(圖10)，CTPK蛋白的T細(xì)胞抗原表位可能有9個(gè)，主要位于4—10、42—52、75—77、90—98、105—113、115—118、123—128、130—140、158—161位氨基酸殘基或其附近，且分布較均勻。

3　討　論

近年來(lái)，斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病在駱駝養(yǎng)殖中仍處于較高的感染水平，由于駱駝主要分布在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)國(guó)家或地區(qū)，導(dǎo)致斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病的相關(guān)研究資料較少，到目前為止，其確切的生活史仍未完全研究清楚。在斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病的防治上，尚缺乏有效的生前診斷方法和防治新措施。本研究通過(guò)克隆CTPK的編碼區(qū)序列，利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)分泌蛋白CTPK進(jìn)行分析，采用不同方法和多種參數(shù)聯(lián)合預(yù)測(cè)，以提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，為駱駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病的生前診斷建立和疫苗研制提供參考。

生物信息學(xué)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種高效的研究手段，促進(jìn)了生物學(xué)研究領(lǐng)域的快速發(fā)展[15]，在寄生蟲(chóng)的研究上，也得到了廣泛應(yīng)用[16]。生物信息學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)和篩選有效的疫苗候選基因[17]。寄生蟲(chóng)的一些分泌性蛋白是蟲(chóng)體的表皮、腸上皮或分泌排泄器官不斷分泌的抗原物質(zhì)。這些抗原暴露于宿主免疫系統(tǒng)，是刺激宿主產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的重要靶抗原，被認(rèn)為是與寄生蟲(chóng)免疫相關(guān)的抗原蛋白，在寄生蟲(chóng)建立寄生生活，免疫調(diào)節(jié)和免疫逃避中起關(guān)鍵作用[18-19]。這些功能性抗原可以為篩選疫苗抗原、發(fā)掘藥物靶點(diǎn)和確定診斷抗原提供依據(jù)[20-21]。

圖7　CTPK蛋白親水性預(yù)測(cè)Fig.7　Prediction of hydrophilicity of CTPK protein

圖8　CTPK蛋白表面可及性預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.8　Prediction of surface probability of CTPK protein

圖9　CTPK蛋白B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.9　Prediction of B-cell antigenic epitopes of CTPK protein

圖10　CTPK蛋白T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.10　Prediction for T-cell antigenic epitopes of CTPK protein

本試驗(yàn)克隆了CTPK的編碼區(qū)序列，采用生物信息學(xué)方法對(duì)分泌蛋白CTPK的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、B/T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明：蛋白質(zhì)理論相對(duì)分子質(zhì)量為20.264 ku，理論等電點(diǎn)為9.53，在組成CTPK蛋白的20種氨基酸中，含量最高的是Lys占8.7%，含量最低的是Trp占0.6%；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為53.22，說(shuō)明該蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定蛋白；總平均親水指數(shù)為-0.925，說(shuō)明該蛋白質(zhì)是親水性蛋白，親水區(qū)的存在有利于蛋白的高效表達(dá)；CTPK蛋白是一種不具有信號(hào)肽序列的非典型分泌蛋白(NN-Score=0.912)，蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分析表明該蛋白質(zhì)不是跨膜蛋白，主要位于胞外區(qū)。利用DNAStar對(duì)斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)CTPK蛋白的T/B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，從該蛋白質(zhì)的親水性與表面可行性等方面分析，該蛋白質(zhì)親水性多肽較多，其合成的多肽很可能易溶于水；表面可行性較高區(qū)域可能位于CTPK蛋白分子表面。綜合分析發(fā)現(xiàn)在1—60、82—95、111—126、133—137、158—162、171—173位氨基酸殘基存在潛在的B細(xì)胞抗原表位；在4—10、42—52、75—77、90—98、105—113、115—118、123—128、130—140、158—161位氨基酸殘基存在潛在的T細(xì)胞抗原表位，具有較好的抗原性，符合寄生蟲(chóng)免疫學(xué)診斷和免疫防治候選基因的特點(diǎn)。本試驗(yàn)為駱駝斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)病早期快速診斷試劑盒的建立奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為其DNA疫苗的研制提供理論依據(jù)。

4　結(jié)　論

擴(kuò)增斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)免疫相關(guān)基因CTPK的CDS區(qū)，其cDNA序列全長(zhǎng)共519 bp，編碼173個(gè)氨基酸，推導(dǎo)CTPK的相對(duì)分子質(zhì)量為20.26 ku，理論等電點(diǎn)為9.53。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)無(wú)跨膜區(qū)，無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組分，親水性氨基酸比例超過(guò)60%；抗原表位預(yù)測(cè)表明，CTPK蛋白是一種抗原性較高的親水性蛋白。推測(cè)CTPK有望用作斯氏副柔線(xiàn)蟲(chóng)的免疫診斷抗原和疫苗候選抗原。

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