安素妨,侯錦娜,王　艷,魯?shù)さ?李保全(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物設(shè)計(jì)中心，河南 鄭州 450002)

隨著擬南芥、水稻[1]等植物全基因組測序的完成，蛋白質(zhì)組學(xué)成為了后基因組時(shí)代的重要領(lǐng)域。由O’Farrell[2]創(chuàng)立的雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)之一，已廣泛應(yīng)用于植物、動物、微生物等蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。雙向電泳技術(shù)步驟較復(fù)雜，有很多因素如上樣量、聚焦時(shí)間、pH膠條的選擇、樣品的制備等，均會影響雙向電泳圖譜的效果[2]，其中樣品的制備尤為關(guān)鍵，因?yàn)橹参锝M織富含的蛋白酶、色素、酚類、多糖、脂類等物質(zhì)均會嚴(yán)重干擾蛋白質(zhì)的提取、分離，導(dǎo)致雙向電泳的結(jié)果不清晰、拖帶，而且重復(fù)性得不到保證。因此，雙向電泳成功的前提和關(guān)鍵在于建立一套高質(zhì)量的、有效的、重復(fù)性高的樣品制備方法，使其有效去除雜質(zhì)并盡可能多地保留蛋白質(zhì)。目前，常用的全蛋白質(zhì)提取方法一般為三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法、苯酚抽提法、Tris-HCl提取法[3-6]，但尚未見對玉米組織預(yù)處理方法的對比研究報(bào)道。

玉米是我國主要的糧食作物，關(guān)于玉米組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究越來越受到人們的重視[5,7-8]。對玉米葉片和籽粒的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究可以深入探索與玉米產(chǎn)量形成及調(diào)控相關(guān)的蛋白質(zhì)和基因；而玉米花粉是玉米籽粒形成的生殖器官，研究玉米花粉的蛋白質(zhì)組學(xué)差異對揭示玉米受精過程具有重要意義[9]。在玉米葉片和花粉的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，玉米組織的樣品制備是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。鑒于此，以玉米葉片和花粉為材料，分別采用丙酮和TCA/丙酮預(yù)處理提取全蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向電泳分離，并采用PDQuest軟件對電泳圖譜進(jìn)行對比，分析蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)量和圖譜質(zhì)量的差異，以期探索出一套適用于玉米蛋白質(zhì)分析的雙向電泳樣品預(yù)處理方法，為玉米蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供技術(shù)條件。

1　材料和方法

1.1　試驗(yàn)材料

挑取籽粒飽滿的鄭單958玉米種子，用75%乙醇消毒15 min，用去離子水沖洗3次以去除種子表面的乙醇，再用3倍于種子體積的去離子水浸泡20 h(25 ℃)，均勻地?cái)[放到培養(yǎng)皿里，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，取其黃化葉為材料。

玉米花粉采集于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原陽試驗(yàn)基地種植的玉米品種鄭單958。

1.2　儀器和試劑

主要試劑：SDS(十二烷基磺酸鈉)、TRIS(三羥甲基氨基甲烷)、尿素、硫脲、碘乙酰胺、DTT(二硫蘇糖醇)、CHAPS(膽固醇氨丙基二甲基氨基丙磺酸)、Tris-飽和酚、IPG buffer、pH值4～7的IPG 11 cm干膠條、考馬斯亮藍(lán)R350、礦物油、Arc、Bis等購自GE公司，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司，TCA、甘氨酸等購自索萊寶公司。

主要儀器：PROTEAN IEF cell等電聚焦系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、JY-SCZ9(JUNYI)Werk Nr離心機(jī)(GeIImany)、紫外可見分光光度計(jì)(Shimadzu)。

1.3　玉米組織蛋白質(zhì)的提取

1.3.1樣品預(yù)處理研缽預(yù)冷，各稱取培養(yǎng)好的黃化葉片4 g、花粉0.1 g兩等份，葉片標(biāo)記為L1、L2，花粉標(biāo)記為P1、P2。稱量好的葉片和花粉分別放入預(yù)冷的研缽中并用液氮充分研磨。L1、P1中加入預(yù)冷的丙酮，L2、P2加入預(yù)冷的10% TCA/丙酮，放于冰上再次研磨，用移液槍將勻漿轉(zhuǎn)至2 mL離心管中，4 ℃條件下14 000 g離心5 min，棄上清，沉淀用冷丙酮沖洗2次，期間每次于-20 ℃下沉淀 30 min，同上條件進(jìn)行離心。將沉淀冷凍干燥成干粉，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2蛋白質(zhì)提取分別稱取處理好的玉米葉片干粉和花粉干粉0.02 g。L1、L2、P1、P2加4 mL提取液(2% SDS、0.1 mol/L pH值7.8的Tris-HCl、20 mmol/L DTT)研磨提取全蛋白質(zhì)，用移液槍分裝至2 mL離心管。95 ℃水浴30 min，25 ℃條件下14 000 g離心5 min，取上清轉(zhuǎn)至新的離心管中，加入等體積的Tris-飽和酚上下顛倒混勻，25 ℃條件下14 000 g離心5 min，取酚相加入5～7倍體積的0.1 mol/L乙酸銨/甲醇混勻后放置于-20 ℃冰箱過夜沉淀。4 ℃下14 000 g離心收集沉淀，沉淀用0.1 mol/L 乙酸銨/甲醇洗滌1次，再用預(yù)冷的丙酮洗滌2次，離心棄上清，冷凍干燥后的沉淀加入裂解液(8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、2% CHAPS、20 mmol/L DTT)充分溶解。

1.3.3蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)定量采用Bradford[10]的方法。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線，取待測蛋白質(zhì)溶液10 μL，加入1 mL考馬斯亮藍(lán)G250顯色液，混勻，在595 nm波長下測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測蛋白質(zhì)的濃度。并將每個(gè)樣品的蛋白質(zhì)含量最終定容至4 μg/μL。

1.4　雙向電泳

1.4.1第一向：等電聚焦第一向采用PROTEAN IEF cell等電聚焦系統(tǒng)。主要參照G?rg等[11]的方法以及Bio-Rad雙向電泳操作指南進(jìn)行，并根據(jù)實(shí)際情況確定了一套適合本試驗(yàn)的操作流程。將定容好的200 μL蛋白質(zhì)溶液沿著水化槽的邊緣由左向右線性加入樣品，不要產(chǎn)生氣泡，否則將影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布，從冰箱中取-20 ℃冷凍保存的IPG線性膠條(11 cm，pH值4～7)，膠面朝下置于水化槽中樣品溶液上，同時(shí)注意不要使膠面與溶液之間產(chǎn)生氣泡，在每根膠條上覆蓋2～3 mL礦物油，置于電泳儀上水化。20 ℃恒溫條件下水化12 h后，按250 V 1 min、300 V 3 h、1 000 V 4 h、8 000 V 4 h、8 000 V 18 h進(jìn)行等電聚焦。等電聚集結(jié)束后，將IPG膠條放于5 mL平衡緩沖液Ⅰ[6 mol/L 尿素、50 mmol/L pH值6.8的Tris-HCl、30%(V/V)甘油、2%(w/V)SDS、0.1 mol/L DTT]中振蕩平衡15 min，再將膠條轉(zhuǎn)入平衡液Ⅱ[6 mol/L尿素、50 mmol/L pH值6.8的Tris-HCl、30%(V/V)甘油、2%(w/V)SDS、0.25 mol/L碘乙酰胺]中振蕩平衡15 min。

1.4.2第二向：SDS-PAGE凝膠電泳平衡結(jié)束以后將膠條轉(zhuǎn)移到12.5%的SDS-PAGE凝膠(20×15×0.1)上，膠與膠條之間避免產(chǎn)生氣泡，進(jìn)行第二向電泳。LX-150溫度控制儀控制循環(huán)水溫為15 ℃，20 mA/gel恒功率30 min后，35 mA/gel恒功率直到溴酚藍(lán)前沿到達(dá)距玻璃板底部1 cm處，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后固定(40%甲醇、10%乙酸，去離子水定容)40 min，倒出固定液，去離子水沖洗3次，用0.1%(w/V)考馬斯亮藍(lán)G250染色3 h，10%(V/V)冰乙酸脫色至膠背景清晰。相機(jī)拍照后用PDQuest(Version 6.2，Bio-Rad，UK)軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　2種預(yù)處理對玉米組織蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜點(diǎn)數(shù)量的影響

分別用丙酮和TCA/丙酮預(yù)處理提取玉米葉片、花粉的總蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種預(yù)處理得到的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜(圖1、圖2)背景淺、分布均勻、蛋白質(zhì)點(diǎn)呈圓形或橢圓形，蛋白質(zhì)點(diǎn)與點(diǎn)之間界限清晰、輪廓分明。丙酮預(yù)處理玉米葉片(圖1A)可檢測到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為634個(gè)，丙酮預(yù)處理玉米花粉(圖2A)可檢測到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為410個(gè)，主要分布在pH值4.5～6.0，但均有少量豎向拖尾；TCA/丙酮預(yù)處理玉米葉片(圖1B)可得到540個(gè)清晰的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)，TCA/丙酮預(yù)處理玉米花粉可得到320個(gè)清晰的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)，明顯少于丙酮預(yù)處理得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)，但無明顯橫向和豎向拖尾，相對丙酮預(yù)處理的雙向電泳圖譜分辨率較高。

A.丙酮預(yù)處理；B.TCA/丙酮預(yù)處理圖1　不同預(yù)處理玉米葉片全蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

A.丙酮預(yù)處理；B.TCA/丙酮預(yù)處理圖2　不同預(yù)處理玉米花粉全蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

2.2　2種預(yù)處理對YUMI 組織蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜點(diǎn)豐度的影響

為了更清楚地解釋分析2種預(yù)處理方法的差異，選取圖1和圖2中不同預(yù)處理相同部位的幾個(gè)區(qū)域(a1和b1、a2和b2、a3和b3；c1和d1、c2和d2)放大(圖3)并用PDQuest軟件進(jìn)行分析比較，玉米葉片放大部分雙向電泳圖譜(a1、a2、a3；b1、b2、b3)顯示，在分子質(zhì)量18.4～66.2 ku的區(qū)域，TCA/丙酮預(yù)處理的玉米葉片蛋白質(zhì)點(diǎn)豐度較丙酮預(yù)處理下降；玉米花粉放大部分雙向電泳圖譜(c1、c2；d1、d2)顯示，在分子質(zhì)量35～116 ku的區(qū)域，TCA/丙酮預(yù)處理的玉米花粉蛋白質(zhì)點(diǎn)豐度較丙酮預(yù)處理下降或消失了，可見，TCA/丙酮預(yù)處理會造成一些高豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)的減弱或丟失，而且丟失的蛋白質(zhì)點(diǎn)大多在酸性區(qū)域。經(jīng)10%TCA/丙酮預(yù)處理后，雜質(zhì)去除的較為干凈，樣品蛋白質(zhì)純度較高，而且可除去糖、色素、酚等干擾電泳效果的物質(zhì)；而直接用丙酮預(yù)處理過的蛋白質(zhì)點(diǎn)較多，相比TCA/丙酮預(yù)處理雜質(zhì)去除得不太干凈?？梢?，用10%TCA/丙酮預(yù)處理比較理想。以上結(jié)果表明，TCA/丙酮預(yù)處理能更有效地去除植物組織中的雜質(zhì)，減少拖尾，但同時(shí)也會造成一些高豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)的減弱或丟失。

a1—a3：丙酮預(yù)處理葉片；b1—b3：TCA/丙酮預(yù)處理葉片；c1—c2：丙酮預(yù)處理花粉；d1—d2：TCA/丙酮預(yù)處理花粉箭頭所指示的部分為丙酮預(yù)處理有而TCA/丙酮預(yù)處理沒有或豐度降低的蛋白質(zhì)點(diǎn)

3　結(jié)論與討論

3.1　植物組織蛋白質(zhì)提取預(yù)處理的作用

分離蛋白質(zhì)組所有蛋白質(zhì)的2個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是其分辨率和可重復(fù)性。付忠軍等[8]、徐幼平等[12]研究發(fā)現(xiàn)，植物未經(jīng)預(yù)處理而直接用各種提取液進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，再用有機(jī)溶劑沉淀，分離出的條帶數(shù)量少，分離度較差。因此，在植物組織蛋白質(zhì)提取之前的樣品處理顯得尤為重要。樣品準(zhǔn)備是獲得高質(zhì)量分辨率雙向電泳圖譜的最關(guān)鍵因素，但也存在很多問題：植物組織中具有豐富的干擾雙向電泳的非蛋白質(zhì)混合物，如酚類、糖類、有機(jī)酸等，致使在雙向電泳中產(chǎn)生橫向或縱向條紋以及拖尾等現(xiàn)象[13]。去除雜質(zhì)有2種方法，一種是在蛋白質(zhì)提取前去除，一種是在蛋白質(zhì)提取后去除[14]，由于玉米葉片和花粉中存在色素，雜質(zhì)不易去除干凈，所以在蛋白質(zhì)提取前去除雜質(zhì)效果較好。通常使用有機(jī)溶劑去除植物組織中的污染物，如丙酮和10%TCA/丙酮[7,14-17]，本試驗(yàn)設(shè)置2種預(yù)處理，用考馬斯亮藍(lán)染色，pH值4～7的固相干膠條分離出的雙向電泳圖譜均顯示雜質(zhì)較少、分辨率較高、背景清晰。其中，丙酮預(yù)處理的玉米組織有少量拖尾，蛋白質(zhì)點(diǎn)豐度高，適合做質(zhì)譜分析;10%TCA/丙酮預(yù)處理的玉米組織沒有拖尾，蛋白質(zhì)點(diǎn)豐度較丙酮預(yù)處理低，適合做蛋白質(zhì)差異分析。

3.2　蛋白質(zhì)提取中其他的干擾因素

蛋白質(zhì)的處理與提取方法有多種，由于其植物組織的化學(xué)成分和各試驗(yàn)的研究目的不同，采用的樣品制備方法也不同[18-22]。蛋白質(zhì)提取樣品的質(zhì)量會影響到電泳的分辨率、重復(fù)性和蛋白質(zhì)圖譜的分離效果。根據(jù)試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)可知，干粉研磨得越細(xì)，雜質(zhì)去除得越干凈。由于液氮研磨后植物組織變得易碎，再進(jìn)一步用丙酮或TCA/丙酮研磨，更易于研磨成細(xì)粉，然后再經(jīng)過苯酚抽提，雜質(zhì)去除得更干凈。有時(shí)，樣品預(yù)處理是影響雙向電泳靈敏度的直接原因。大量研究證明，材料研磨應(yīng)在4 ℃下進(jìn)行，防止蛋白質(zhì)降解。所有洗滌液需要在-20 ℃預(yù)冷至少1 h。用預(yù)冷的丙酮和TCA研磨以及預(yù)冷的乙酸銨/甲醇沉淀(-20 ℃，30 min或過夜)，可有效減少葉片或花粉中色素、多酚對蛋白質(zhì)純度的影響。加樣量也會影響電泳圖譜的分析，高加樣量有助于低豐度蛋白質(zhì)的檢測，而加樣量過高又會掩蓋與其相似的低豐度蛋白質(zhì)的表達(dá)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可知，12.5% SDS-PAGE膠，11 cm的IPG膠條，加樣量為800 μg最佳，蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)清晰。在對雙向電泳圖譜進(jìn)行對比試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)選在同批次做，圖譜結(jié)果才不會受到影響，所以要保證在相同的條件下進(jìn)行電泳，比如試劑配方、電泳條件等。

總之，在植物組織蛋白質(zhì)提取過程中，TCA和丙酮去除了大部分的干擾物質(zhì)，有利于下一步蛋白質(zhì)的苯酚抽提和雙向電泳。盡管材料預(yù)處理耗時(shí)耗力，但是對于一些較難提取蛋白質(zhì)的植物材料，卻能提出較高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品。所以，蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理是雙向電泳成功分離蛋白質(zhì)的關(guān)鍵，樣品蛋白質(zhì)的純度和可溶性直接影響雙向電泳的分離結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，用丙酮預(yù)處理研磨或10% TCA/丙酮預(yù)處理研磨玉米組織，并且在制備蛋白質(zhì)干粉過程中采用預(yù)冷丙酮及預(yù)冷的TCA研磨蛋白質(zhì)，不僅有效抑制了蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解作用，還可除去一些植物組織本身含有的干擾物質(zhì)，從而獲得較好的雙向電泳圖譜。

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