劉艷芬，王秀萍，陳翠果，趙　敏，梁偉玲，王婷婷，董秀秀(.河北工程大學(xué) 園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北 邯鄲 0560； .唐山市植物耐鹽研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省農(nóng)林科學(xué)院 濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北 唐山0600； .河北省邯鄲市廣平縣農(nóng)牧局，河北 邯鄲 057600)

蒲公英是對菊科蒲公英屬(Taraxacum)植物的泛稱，全屬約2 000種，我國有70多個(gè)種和變種。蒲公英不僅是傳統(tǒng)的中藥材，還具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值。隨著對其化學(xué)成分和藥理作用研究的逐步深入，集食用和藥用于一身的蒲公英已作為特種優(yōu)質(zhì)保健蔬菜[1]，越來越受到國內(nèi)外人們的青睞，在我國已進(jìn)行大規(guī)模栽培。蒲公英屬植物種類繁多，一些生長在鹽漬環(huán)境中的種類生物量小，難以在鹽堿地區(qū)獲得高產(chǎn)[2]。由于在鹽漬化土壤和海水或咸水脅迫下生長的植物能夠更多地積累營養(yǎng)元素和活性物質(zhì)，具有更好的營養(yǎng)、藥用和其他經(jīng)濟(jì)品質(zhì)[3]，因此，通過多種途徑篩選和培育耐鹽的經(jīng)濟(jì)植物尤為必要。通過組織培養(yǎng)獲得愈傷組織的耐鹽突變體，進(jìn)而培育出耐鹽的品種或品系，是蒲公英生物技術(shù)抗性育種的研究方向之一。本研究以大葉蒲公英葉片為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織后，將愈傷組織接種在含不同濃度鹽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行鹽脅迫，篩選出耐鹽的愈傷組織突變體,旨在為蒲公英的耐鹽生物技術(shù)育種和離體再生提供依據(jù)，也為更好地開發(fā)和利用蒲公英奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　材料

將大葉蒲公英種子盆栽播種，剪取生長20～30 d的蒲公英葉片為外植體。

1.2　方法

1.2.1愈傷組織誘導(dǎo)條件的確定

1.2.1.1愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選將蒲公英葉片剪成1 cm2的小塊，常規(guī)消毒后，將外植體分別接種到含有不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，接種45 d后統(tǒng)計(jì)各處理愈傷組織的發(fā)生率和生長狀況。

1.2.1.2愈傷組織誘導(dǎo)光照條件的篩選將接種于MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.04 mg/L誘導(dǎo)培養(yǎng)基的葉片外植體，分別在全光照、16 h/d光周期、全黑暗條件下培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的發(fā)生率和愈傷組織狀態(tài)。

1.2.2愈傷組織繼代培養(yǎng)條件的篩選

1.2.2.1愈傷組織繼代培養(yǎng)基的篩選在原有試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將同一來源的蒲公英愈傷組織分別繼代于含有不同質(zhì)量濃度生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的繼代培養(yǎng)基中。細(xì)胞分裂素類物質(zhì)設(shè)3個(gè)水平，分別為6-BA 0.2、0.4、0.6 mg/L；生長素類物質(zhì)設(shè)2個(gè)水平，分別為2,4-D 0.02 mg/L+NAA 0.2 mg/L，2,4-D 0.04 mg/L，進(jìn)行兩因素完全隨機(jī)試驗(yàn)。每處理繼代10瓶，每3周繼代1次，連續(xù)繼代3次(重復(fù)3次)，統(tǒng)計(jì)每次各處理愈傷組織生長狀況與增殖率，據(jù)此確定愈傷組織繼代培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的最佳濃度組合。

1.2.2.2愈傷組織繼代培養(yǎng)溫度的篩選將蒲公英愈傷組織分別培養(yǎng)于18、20、23、25、27 ℃條件下，根據(jù)愈傷組織的生長速度和生長狀況，確定適合愈傷組織繼代培養(yǎng)的溫度條件。

1.2.3愈傷組織耐鹽突變體的篩選與鑒定

1.2.3.1愈傷組織鹽脅迫與突變體篩選將繼代5次的愈傷組織切成0.5 cm2的小塊，分別接種于最佳繼代培養(yǎng)基附加NaCl質(zhì)量濃度為0、5、8、10、12、15、18、20 g/L的培養(yǎng)基進(jìn)行鹽脅迫培養(yǎng)。每個(gè)處理各12瓶，每瓶接入4～5塊生長良好的愈傷組織。每3周繼代1次，繼代4次后，NaCl質(zhì)量濃度為20 g/L的培養(yǎng)基中，愈傷組織全部死亡。選出其余培養(yǎng)基上存活下的愈傷組織，轉(zhuǎn)入無鹽和含鹽培養(yǎng)基交替培養(yǎng)，以期獲得愈傷組織耐鹽突變體。

1.2.3.2愈傷組織耐鹽突變體的鑒定與RAPD分析將對照愈傷組織與在NaCl質(zhì)量濃度為0、5、8、10、12、15、18 g/L的培養(yǎng)基上存活的愈傷組織，轉(zhuǎn)到無鹽的繼代培養(yǎng)基上擴(kuò)增培養(yǎng)2個(gè)月，分別標(biāo)記為CK、y0、y1、y2、y3、y4、y5、y6(代號分別標(biāo)記為1—8)，進(jìn)行RAPD檢測。DNA提取采用DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根，北京)。利用NanoDrop 2000檢測DNA在260 nm和280 nm處的吸光值，根據(jù)這2個(gè)值的比值確定DNA的純度。DNA的完整性通過瓊脂糖凝膠電泳和持家基因matK的擴(kuò)增進(jìn)行檢測。共采用15條隨機(jī)引物對耐鹽愈傷組織與對照進(jìn)行RAPD分析。

在整個(gè)組織培養(yǎng)過程中，如無特殊情況說明，培養(yǎng)條件為：溫度(23±2)℃，每天光照16 h，光照強(qiáng)度2 500 lx。培養(yǎng)基中瓊脂5.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH值5.8。

2　結(jié)果與分析

2.1　愈傷組織誘導(dǎo)條件的確定

2.1.1葉片不同部位對愈傷組織發(fā)生的影響將葉片分別接種于含不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基中(圖1A)，不同處理誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織的狀況有所不同，結(jié)果見表1。在處理1、處理2的培養(yǎng)基中，愈傷組織發(fā)生率較低，面積小，質(zhì)地緊湊。處理3—5，隨著2,4-D質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織的發(fā)生率逐漸提高，且愈傷組織面積逐漸變大。但是在處理5中的愈傷組織質(zhì)地變得疏松，不利于繼代培養(yǎng)，這可能與培養(yǎng)基中2,4-D質(zhì)量濃度過高有關(guān)。綜合分析，選擇處理4，即MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.04 mg/L，作為愈傷組織誘導(dǎo)的合適培養(yǎng)基。

綜合處理1—5的愈傷組織發(fā)生情況來看，所切離的小塊葉片邊緣，不同部位愈傷組織的發(fā)生量不同，含葉脈處比不含葉脈處愈傷組織發(fā)生速度快，愈傷組織面積大(圖1B)。因此，盡量選擇葉脈處附近的葉片作為外植體，以獲得更多的愈傷組織。

圖1　接種的葉片外植體(A)及葉脈產(chǎn)生的愈傷組織(B)

表1　不同培養(yǎng)基配方對蒲公英愈傷組織發(fā)生的影響

2.1.2不同光照條件對愈傷組織發(fā)生的影響將接種在相同配方MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.04 mg/L上的外植體，分別放在不同光照條件下、相同溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察愈傷組織生長情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。在全光照(光照強(qiáng)度為2 500 lx)條件下，愈傷組織的發(fā)生率較低，面積較小。在全黑暗和16 h/d光周期(光照強(qiáng)度為2 500 lx)條件下，愈傷組織發(fā)生率較為接近，發(fā)生面積均較大，但黑暗條件下愈傷組織為白色，略顯疏松。結(jié)果表明，全光照對蒲公英葉片愈傷組織的發(fā)生有一定阻礙作用，全黑暗處理對愈傷組織的發(fā)生沒有明顯促進(jìn)作用。綜合分析，選擇16 h/d光周期作為蒲公英愈傷組織誘導(dǎo)的光照培養(yǎng)條件，既能節(jié)約能源，又能獲得良好的愈傷組織。

表2　不同光照條件對蒲公英愈傷組織發(fā)生的影響

2.2　愈傷組織繼代培養(yǎng)條件的確定

2.2.1生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對愈傷組織增殖的影響在原有試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將初代培養(yǎng)的蒲公英愈傷組織分別繼代于含有不同種類和質(zhì)量濃度生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的6種繼代培養(yǎng)基中，每21 d繼代1次，連續(xù)繼代3次，統(tǒng)計(jì)每次各處理愈傷組織生長狀況和增殖率，結(jié)果見表3。如表3所示，處理3、處理4與處理5中愈傷組織的增殖率最高，與其他處理有顯著差異，三者增殖率差異不顯著。但是處理5的愈傷組織表現(xiàn)為黃綠色、質(zhì)地較緊實(shí)，不利于分化再生。因此，選擇處理3，即MS+6-BA 0.4 mg/L+2,4-D 0.02 mg/L+NAA 0.2 mg/L，作為蒲公英愈傷組織最佳繼代培養(yǎng)基。在此培養(yǎng)基上，愈傷組織的生長狀況最好，且增殖率最大。

表3　不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對蒲公英愈傷組織繼代的影響

注：增殖率為每次繼代后所得的培養(yǎng)物(愈傷組織)的數(shù)量與上一次數(shù)量的比值。表中同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2.2培養(yǎng)溫度對愈傷組織增殖的影響將篩選出的最佳繼代培養(yǎng)基中的愈傷組織分別培養(yǎng)于18、20、23、25、27 ℃條件下，觀察愈傷組織生長狀況，結(jié)果見表4。隨著培養(yǎng)溫度的提高，愈傷組織的生長速度加快。溫度過低(溫度18 ℃)時(shí)，愈傷組織生長慢，增殖率低。溫度過高時(shí)(溫度27 ℃)時(shí)，愈傷組織由于生長過快，質(zhì)地過于疏松，不利于繼代，增殖率也明顯降低。處理4(溫度23 ℃)的蒲公英愈傷組織生長速度快，生長狀況良好。因此，選擇23 ℃作為蒲公英愈傷組織繼代培養(yǎng)的溫度條件。

表4　不同溫度對蒲公英愈傷組織繼代培養(yǎng)的影響

2.3　愈傷組織耐鹽突變體的獲得與RAPD分析

2.3.1愈傷組織耐鹽突變體獲得將繼代培養(yǎng)的普通愈傷組織接種到NaCl質(zhì)量濃度為0、5、8、10、12、15、18、20 g/L的培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)7 d后愈傷組織開始變褐，14～21 d后逐漸死亡，28 d后絕大部分愈傷組織變褐死亡，見圖2。但在變褐死亡的個(gè)別愈傷組織內(nèi)部，有黃綠色的愈傷組織團(tuán)，將長出的新鮮愈傷組織接種到含有相應(yīng)NaCl質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基上繼續(xù)耐鹽培養(yǎng)，每21 d繼代1次，耐鹽繼代4次后，NaCl質(zhì)量濃度為20 g/L的愈傷組織全部死亡。選出存活的愈傷組織(圖3)，轉(zhuǎn)入無鹽和含鹽培養(yǎng)基交替培養(yǎng)2次。之后在無鹽培養(yǎng)基上增殖，以獲得更多的耐鹽愈傷組織(圖4)。

2.3.2愈傷組織耐鹽突變體RAPD檢測將對照與NaCl質(zhì)量濃度分別為0、5、8、10、12、15、18 g/L的培養(yǎng)基上的耐鹽愈傷組織進(jìn)行RAPD檢測，確定突變體(代號分別標(biāo)記為1—8)。共采用15條隨機(jī)引物對耐鹽突變體和對照進(jìn)行RAPD分析，隨機(jī)引物分別是S36、S224、S262、S267、S308、S358、OPA-19、OPC-05、OPD-05、OPG-06、SJ14、OPC-11、OPB-12、S90、S309。結(jié)果表明，其中S358引物對6號(y4)愈傷組織擴(kuò)增出了與對照不同的差異條帶(圖5A)。

圖2　不同鹽濃度脅迫下的愈傷組織

圖3　鹽脅迫后存活的愈傷組織

圖4　增殖的愈傷組織突變體

同時(shí)，OPA-19引物對5號(y3)愈傷組織擴(kuò)增出了與對照不同的差異條帶。OPC-05引物對4號(y2)愈傷組織擴(kuò)增出了與對照不同的差異條帶(圖5B)。

M：Marker；1—8：CK、y0、y1、y2、y3、y4、y5、y6
圖5耐鹽愈傷組織的RAPD檢測

因此，y4、y3、y2這3組的遺傳物質(zhì)，即在NaCl質(zhì)量濃度分別為12、10、8 g/L培養(yǎng)基上存活下來的愈傷組織遺傳物質(zhì)發(fā)生了變異，證明本次試驗(yàn)獲得的蒲公英耐鹽愈傷組織確實(shí)產(chǎn)生了DNA的變異。

3　結(jié)論與討論

本試驗(yàn)以蒲公英葉片為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織形成的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.04 mg/L，光照條件為光周期16 h/d(光照強(qiáng)度為2 500 lx)。葉片愈傷組織繼代增殖的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.4 mg/L+2,4-D 0.02 mg/L+NAA 0.2 mg/L。繼代培養(yǎng)合適溫度為23 ℃。在此條件下，愈傷組織生長速度快，質(zhì)地良好，為蒲公英耐鹽愈傷組織的篩選打下基礎(chǔ)。

將愈傷組織接種在含有不同質(zhì)量濃度鹽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過4次耐鹽脅迫，篩選出了耐鹽的愈傷組織突變體。通過RAPD檢測，發(fā)現(xiàn)在NaCl質(zhì)量濃度為8、10、12 g/L的培養(yǎng)基上存活下來的愈傷組織DNA發(fā)生了變異，獲得了相應(yīng)鹽濃度下的耐鹽愈傷組織突變體。

利用組織和細(xì)胞培養(yǎng)篩選耐鹽性較高的突變體植株在我國已取得了很大進(jìn)展[3-5]。已有的研究表明，獲得耐鹽愈傷組織的方法一般有2種，一是將外植體直接接種到含鹽培養(yǎng)基上誘導(dǎo)耐鹽愈傷組織[6]；二是將普通的愈傷組織轉(zhuǎn)移到鹽濃度恒定[7-8]或逐次遞增[9-12]的培養(yǎng)基上，通過多次繼代，選出穩(wěn)定生長的愈傷組織。將愈傷組織直接置于含有高于選擇濃度NaCl的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，雖然可減少形成生理適應(yīng)細(xì)胞，但有可能淘汰某些本來可能存在的變異。張新果等[7]將蒲公英愈傷組織直接繼代到含15 g/L NaCl的培養(yǎng)基上，獲得了12株耐15 g/L NaCl的藥蒲公英再生植株。本試驗(yàn)將蒲公英葉片愈傷組織接種在鹽濃度遞增的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，篩選出了耐鹽的愈傷組織突變體。雖然此種方法容易產(chǎn)生生理適應(yīng)的細(xì)胞或組織，但是本試驗(yàn)中獲得了不同耐鹽級別的蒲公英愈傷組織變異系。將不同耐鹽級別的愈傷組織突變體再生出完整植株，并進(jìn)行田間耐鹽鑒定是進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

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