楊玥欣　沈夏波　武雅靜　桂　麗　賈雪梅

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，安徽　合肥　230032)

研究發(fā)現(xiàn)高脂血癥患者伴隨有口渴的癥狀，這可能與下頜下腺的唾液分泌功能異常有關(guān)〔1〕。水通道蛋白(AQPs)是一類具有轉(zhuǎn)運水和其他小分子可溶物的蛋白質(zhì)家族，在唾液分泌過程中起重要作用。AQP2是唯一一種功能受控的AQP5，AQP5可能是AQP2表達的校準(zhǔn)器〔2〕。高脂血癥大鼠下頜下腺中AQP5的表達存在異?！?〕，但AQP2 的表達是否隨之改變還未闡明。AQP4可在細胞間快速轉(zhuǎn)運水，且該作用受AQP4四聚體結(jié)構(gòu)的阻礙〔3〕。AQP4在高脂血癥患者下頜下腺的表達變化也不清楚。本實驗觀察高脂血癥組大鼠下頜下腺AQP2和AQP4的表達變化。

1　材料和方法

1.1試劑AQP2和AQP4的抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)、SP 免疫組織化學(xué)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2高脂血癥動物模型復(fù)制雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量110～160 g，安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，普通級，隨機分為兩組，每組10只。對照組予以全價飼料喂養(yǎng)；高脂血癥組給予高脂飲食(膽固醇 2%、 豬油10%、 基礎(chǔ)飼料 88%)，復(fù)制高脂血癥模型；連續(xù)觀察2個月，各組動物均不限制飲食和飲水。

1.3標(biāo)本制備用20%烏拉坦1 ml/100 g，腹腔注射，麻醉后剖開腹腔，下腔靜脈取血，行三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)檢測；取下頜下腺固定于10%甲醛溶液，常規(guī)石蠟包埋，切片4 μm。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色切片脫蠟至水，入蘇木精染色15 min，再進行鹽酸乙醇分色、藍化、伊紅染色、脫水、透明和封片，顯微鏡下觀察下頜下腺病理學(xué)改變。

1.5免疫組化染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)，微波爐高火8 min，靜置3 min，再高火4 min，冷卻至室溫。3%H2O2，37℃孵育20 min；滴加AQP2一抗溶液(1∶200)和AQP4一抗溶液(1∶100)，滴加50 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，4℃過夜，切片從冰箱取出恢復(fù)至室溫；滴加二抗(生物素標(biāo)記的山羊抗兔的IgG)，37℃孵育30 min；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min。以上步驟之間都以PBS沖洗3次×3 min。滴加DAB顯色3 min。自來水沖洗；蘇木精復(fù)染，放入自來水中藍化，脫水，透明和封片。在10×40倍光鏡下，利用Nikon彩色數(shù)碼CCD攝像頭捕獲各組切片中AQP2和AQP4的圖像，每張切片隨機選取6個視野，再用捷達生物圖像軟件計算各組AQP2和AQP4免疫陽性細胞的平均光密度值(MOD)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1兩組血脂水平比較對照組TG〔(0.784 8±0.212 7)mmol/L〕、TC〔(1.250 6±0.353 9)mmol/L〕水平明顯低于高脂血癥組〔(2.761 8±0.526 0)mmol/L、(5.822 3±0.981 9)mmol/L，P<0.05〕。

2.2兩組下頜下腺病理學(xué)觀察對照組大鼠腺泡飽滿，結(jié)構(gòu)清晰。高脂血癥組大鼠腺泡萎縮，直徑變小，可見結(jié)締組織增生，見圖1。

2.3兩組下頜下腺AQP2免疫組化表達對照組和高脂血癥組大鼠下頜下腺AQP2都呈陽性，大多呈棕褐色。在黏液性腺泡區(qū)，AQP2免疫陽性反應(yīng)物主要沉積于紋狀管導(dǎo)管上皮胞質(zhì)內(nèi)；在漿液性腺泡區(qū)，AQP2主要在紋狀管表達，腺泡中也有表達，而顆粒曲管中則無表達，見圖2。對照組(0.926 1±0.066 2)和高脂血癥組下頜下腺AQP2表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(0.981 9±0.177 9,P>0.05)。

2.4兩組下頜下腺AQP4免疫組化表達在黏液性腺泡區(qū)，對照組、高脂血癥組下頜下腺AQP4免疫陽性反應(yīng)物主要沉積在紋狀管導(dǎo)管上皮細胞，呈棕褐色；在漿液性腺泡區(qū)，AQP4主要表達在紋狀管，腺泡中也有表達，但顆粒曲管中無表達，見圖3。與對照組(1.098 6±0.083 4)相比，高脂血癥組AQP4免疫陽性反應(yīng)物表達明顯減弱(1.009 8±0.086 6,t=2.374,P<0.05)，呈淺棕黃色。

圖1　兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)組織結(jié)構(gòu)(HE，×400)

圖2　兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)AQP2表達(DAB，×400)

圖3　兩組下頜下腺黏液性、漿液性腺泡區(qū)AQP4表達(DAB，×400)

3　討　論

AQP2主要表達在腎臟結(jié)合小管和集合管的主細胞，與糖尿病腎病關(guān)系密切〔2,4,5〕。本文結(jié)果顯示，與正常大鼠比較，高脂血癥大鼠下頜下腺AQP2的表達無明顯變化。AQP2的量和細胞定位受到多種激素和信號分子的影響，包括精氨酸加壓素(AVP)。高鈉血癥或低血容量時，AVP從垂體后葉分泌到血流中〔6〕，它促成細胞內(nèi)從小囊泡到頂膜的AQP2水通道蛋白的重新分配〔7〕，增強水的重吸收及其跨膜轉(zhuǎn)運〔5〕。AVP受體主要存在于全身血管平滑肌、腎臟遠端后端和集合管上皮細胞以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)〔8〕，而目前尚未有AVP受體在大鼠下頜下腺中表達的報道。據(jù)此推測，AVP受體在大鼠下頜下腺中表達含量過低或不表達可能導(dǎo)致高脂血癥大鼠AQP2的表達不受影響。AQP4廣泛分布于體內(nèi)，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎、肺、結(jié)腸，也可在支氣管上皮表達〔9〕。有實驗證明AQP4在干燥綜合征大鼠下頜下腺表達〔10〕，AQP4是維持下頜下腺水平衡的重要水通道蛋白，在唾液形成的過程中有重要的作用。本文顯示與正常大鼠比較，高脂血癥大鼠下頜下腺AQP4的表達明顯下降，據(jù)此推測，AQP4表達減少會導(dǎo)致下頜下腺導(dǎo)管對水的轉(zhuǎn)運功能下降，引起唾液的分泌量減少，這可能是導(dǎo)致高脂血癥患者口渴的原因之一。AQP4表達減少的原因可能有：①缺血缺氧使AQP4的表達發(fā)生改變。據(jù)報道，缺氧/缺血 24 h后，大腦組織中血管和突觸周圍星形膠質(zhì)細胞足突上的AQP4 表達下降，使星形膠質(zhì)細胞死亡〔11〕。而高脂血癥的直接損害是加速全身動脈粥樣硬化，一旦動脈被粥樣斑塊堵塞，就會導(dǎo)致局部組織如下頜下腺缺氧缺血，引起AQP4 表達下降。②高脂血癥時游離的脂肪酸和TG的升高導(dǎo)致胰島素抵抗，下頜下腺組織出現(xiàn)葡萄糖代謝障礙，導(dǎo)致AQP4合成能量不足，AQP4表達下降。③蛋白激酶C和MAPKs信號通路參與AQP4的表達調(diào)節(jié)〔12〕，有研究表明在高脂血癥大鼠的胰腺中蛋白激酶C活化，據(jù)此推測，蛋白激酶C激活可以抑制下頜下腺中的AQP4基因的表達，減少mRNA的產(chǎn)生〔13〕。而高脂血癥大鼠血液中的TG和TC的慢性刺激可誘導(dǎo)蛋白激酶C的活化，使下頜下腺AQP4表達減少。④根據(jù)翻譯起始處蛋氨酸M1和M23的不同，將AQP4分為兩個亞型，內(nèi)源性AQP4是同時含有M1(含 323 個氨基酸 )和M23(含有 301 個氨基酸)的四聚體，它們共同組成四聚體存在于細胞膜上〔14〕。高脂血癥大鼠下頜下腺中也可能由于AQP4亞型結(jié)合的比例失調(diào)，導(dǎo)致表達的下降，使其轉(zhuǎn)運水的功能發(fā)生改變。

1崔芳芹，賈雪梅，汪淵，等.高脂血癥大鼠下頜下腺內(nèi)AQP1和AQP5表達及意義〔J〕.中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2012；21(1)：74-8.

2Wu H，Chen L，Zhang X，etal.Aqp5 is a new transcriptional target of Dot1a and a regulator of Aqp2〔J〕.PLoS One，2013；8(1)：1-12.

3Tani K，F(xiàn)ujiyoshi Y.Water channel structures analysed by electron crystallography〔J〕.Biochim Biophys Acta，2014；1840(5)：1605-13.

4Sales AD，Lobo CH，Carvalho AA，etal.Structure，function，and localization of aquaporins：their possible implications on gamete cryopreservation〔J〕.Genet Mol Res，2013；12(4)：6718-32.

5Kortenoeven ML，F(xiàn)enton RA.Renal aquaporins and water balance disorders〔J〕.Biochim Biophys Acta，2014；1840(5)：1533-49.

6Voisin DL，Bourque CW.Integration of sodium and osmosensory signals in vasopressin neurons〔J〕.Trends Neurosci，2002；25(4)：199-205.

7Katsura T，Gustafson CE，Ausiello DA，etal.Protein kinase A phosphorylation is involved in regulated exocytosis of aquaporin-2 in transfected LLC-PK1 cells〔J〕.Am J Physiol，1997；272(6 Pt 2)：F817-22.

8王鑫，陳長選.精氨酸血管升壓素與夜間多尿關(guān)系的研究進展〔J〕.中國實用醫(yī)刊，2013；40(7)：107-8.

9丁建中，賀尚榮，張燕翔，等.水通道蛋白4在外燥小鼠肺組織表達的實驗研究〔J〕.長江大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2010；7(3)：1-2；28.

10Nakamura M，Saga T，Watanabe K，etal.An immunohistochemistry-based study on aquaporin (AQP)-1，3，4，5 and 8 in the parotid glands，submandibular glands and sublingual glands of Sj?gren′s syndrome mouse models chronically administered cevimeline〔J〕.Kurume Med J，2013；60(1)：7-19.

11黃鶴鳴，褚曉凡.AQP4與星形膠質(zhì)細胞脹亡之間的關(guān)系〔J〕.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2013；20(10)：21-3,29.

12宋富強，郭文瓊，呼永河.AQP4在促進腦水腫形成和消退中的雙重角色〔J〕.西南軍醫(yī)，2013；15(5)：497-500.

13王亞軍，孫家邦，李非，等.高脂血癥對急性胰腺炎的影響〔J〕.實用醫(yī)學(xué)雜志，2008；24(18)：3108-10.

14劉俊秀，賴蓉，鐘德霞.表達AQP4不同亞型的細胞系檢測AQP4抗體敏感性的研究〔J〕.中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)，2012；33(5)：587-91.