盧明智 李長征 曾雨冰 楊為祝 張宇靈

(福建中醫(yī)藥大學(xué), 1 臨床醫(yī)學(xué)2014級, 2 解剖學(xué)教研室, 福州 350122)

實驗發(fā)現(xiàn)，利用尿素混合物進(jìn)行浸泡，可以使生物標(biāo)本變透明。日本科學(xué)家使用這種方法處理小鼠的腦切片，成功制作了完全透明而且不影響熒光信號的小鼠全腦標(biāo)本[1]。在透明標(biāo)本制作領(lǐng)域中，通常使用堿透明法、甘油透明法、改進(jìn)堿甘油透明法及冬青油透明法[2-5]。而尿素透明法建立在傳統(tǒng)甘油透明法的基礎(chǔ)上，對透明方法進(jìn)行了較大的改良，使得透明標(biāo)本的制作在效果良好的情況下更好地保證了組織的完整性和致密程度，大大縮短透明時間，提高了標(biāo)本制作的成功率, 現(xiàn)報道如下。

1 實驗

1.1 實驗材料

蟾蜍、生理鹽水、茜素紅染劑、尿素、曲拉通(Triton X-100)、甘油、廣口瓶、止血鉗、鑷子、手術(shù)剪、手術(shù)刀。

1.2 實驗前準(zhǔn)備

將蟾蜍處死，剝皮，去除內(nèi)臟，沖洗血液，放入10%甲醛溶液固定1周后備用。透明液的配置：尿素240 g、10%甘油1 L、Triton X-100 1 ml，混合備用。染液的配置：1%氫氧化鉀溶液100 ml，加入0.1%茜素紅3～4滴，現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存。

1.3 制作方法和步驟

將固定完成的蟾蜍放入透明液中，1周左右，當(dāng)透明液變黃時及時更換，待標(biāo)本半透明至可見骨骼后取出。用生理鹽水沖洗，洗去浮液。將蟾蜍移入茜素紅染液中，完全浸沒，避光染色3～4 d，待椎骨完全著色后即可取出。用生理鹽水洗去浮色后，放入30%甘油中，待肌肉顏色脫去。甘油按照80%、90%、100%的濃度對標(biāo)本進(jìn)行梯度透明，每個梯度浸泡2～4 d，使標(biāo)本內(nèi)的水完全脫去后放入純甘油溶液中保存。

2 結(jié)果

經(jīng)過此法制作出的透明標(biāo)本，除骨骼外基本完全透明，骨骼染色清晰可見，形態(tài)完整，未出現(xiàn)塌陷變形，結(jié)構(gòu)緊密，極大程度上減輕了傳統(tǒng)透明標(biāo)本法中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)軟爛變形現(xiàn)象。肌肉組織富有彈性，呈膠凍狀，且無氣泡產(chǎn)生(圖1)。

3 討論

3.1 尿素透明劑的作用

尿素具有一定的溶解蛋白質(zhì)的作用。高濃度尿素可使蛋白質(zhì)的多肽主鏈及其氨基酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)改變，從而令蛋白質(zhì)溶解，使組織透明。而Triton X-100作為非離子表面活性劑, 具有破膜作用，而且在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定，不易受強(qiáng)電解質(zhì)影響。通過破壞細(xì)胞膜的屏障作用，使得甘油更易滲透進(jìn)組織中，同時由于甘油具有親水性，當(dāng)甘油滲透到組織中，可與組織中的水結(jié)合，改變生物組織的折射率，從而使其變得透明[5]。故甘油中混入尿素透明劑會比單純的甘油混合液透明效果更好，透明時間更短。

圖1 蟾蜍透明標(biāo)本

3.2 此法優(yōu)點

3.2.1 標(biāo)本完整，透明度高，不易產(chǎn)生氣泡 實驗結(jié)果證明，相對于使用堿預(yù)透明再用甘油透明的方法，使用尿素混合物透明的標(biāo)本，柔軟有彈性，呈膠凍狀，極大提高了標(biāo)本的完整性，結(jié)構(gòu)不易散架，且不易產(chǎn)生氣泡，標(biāo)本的美觀性好。

3.2.2 操作簡單，影響因素少 單純使用甘油透明，需要用不同梯度濃度的甘油進(jìn)行階段透明，使用水楊酸甲酯透明則不僅要各級乙醇脫水，還需要二甲苯等透明劑初步透明，材料損耗大，耗時長，操作繁瑣且危險，而堿透明法對透明標(biāo)本本身組織結(jié)構(gòu)的損害嚴(yán)重。與此相比，使用尿素混合物透明則操作較為簡單，較大程度上避免了制作過程中對標(biāo)本組織的損害。

同時，傳統(tǒng)透明標(biāo)本染色法中使用的堿溶液透明，其堿溶液受溫度的影響較大，而改良法則受溫度影響較小，使得受到的影響因素較少，且易于控制，成功率高。