李 　楊 邢 　龍#MOHAMMED H 馬小龍謝富強(qiáng)* 馮正虎 車(chē)銀富

（1. 蘭 州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，甘肅 　蘭 州 　730000；2. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 　蘭 州 　730000；3. 西

北民族大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 　730030；4. 西北民族大學(xué)甘肅省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/培育基地，甘肅 　蘭 州 　730030）

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是惡性程度高、預(yù)后差的腫瘤之一。臨床資料表明，TSCC具有女性多發(fā)、早期淋巴結(jié)侵犯、多發(fā)性原發(fā)癌的局部高復(fù)發(fā)率的臨床特征[1]。相較于唇、頰及口底等部位，TSCC在年輕成人中好發(fā)于舌外側(cè)緣，舌背非常罕見(jiàn)，舌背正中的發(fā)生率不足1%[2]；目前，早期舌癌的治療多選擇手術(shù)部分切除、放射治療為主，廣泛切除和重建手術(shù)是幫助晚期舌癌患者延續(xù)生命、提高生活質(zhì)量的治療方案[3]。

硫氧還蛋白系統(tǒng)(Trx system)是氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，包括硫氧還蛋白還原酶(TrxR)、NADPH輔酶、Trx家族蛋白和Trx的調(diào)節(jié)蛋白[4]?，F(xiàn)有研究已證明Trx系統(tǒng)蛋白與癌癥密切相關(guān)，并與癌癥臨床病理特征顯著相關(guān)[5]。本研究用免疫組織化學(xué)及Image Pro Plus軟件分析技術(shù)，研究TSCC組織與癌旁正常上皮組織中Trx和TrxR1 蛋白的表達(dá)情況，初步探究Trx系統(tǒng)蛋白與TSCC的潛在關(guān)系，以期為T(mén)SCC的早診斷、早治療提供參考。

1　材料與方法

1.1　病理標(biāo)本和臨床資料收集

收集蘭州大學(xué)第一、第二醫(yī)院2009年4月—2016年1月病理確診為T(mén)SCC手術(shù)切除標(biāo)本28例，男性17例，女性11例；年齡32～72歲(平均51.25歲)，小于50歲者12例、大于50歲者(含50歲)16例；腫瘤直徑在≤2 cm者14例、2 cm＜腫瘤直徑≤4 cm者10例、＞4 cm者4例；隨訪(fǎng)時(shí)間24～72個(gè)月，平均隨訪(fǎng)時(shí)間43.72個(gè)月；局部復(fù)發(fā)7例；目前存活18例、死亡7例、隨訪(fǎng)丟失3例。

病理診斷均為鱗狀細(xì)胞癌，其中高分化14例、中分化9例、低分化5例；按國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)(UICC)口腔癌和口咽癌的TNM分類(lèi)分期(UICC 2002)標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期8例、Ⅱ期6例、Ⅲ期10例、Ⅳ期4例；臨床及術(shù)后病理確診頸部淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移10例。另選擇10例癌旁病理診斷為正常的舌組織作為對(duì)照組進(jìn)行研究，上述標(biāo)本均經(jīng)病理科醫(yī)師對(duì)HE染色片進(jìn)行觀察、篩選，作為免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究用片。

1.2　主要試劑

兔抗人TrxR1多克隆抗體(11117-1-AP)和兔抗人Trx多克隆抗體(14999-1-AP)均購(gòu)自美國(guó)ProteinTech 公司；SP-9000/9001/9002生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測(cè)試劑盒和ZLI-9017/9018/9019濃縮型DAB試劑盒均購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司；粘附載玻片購(gòu)自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3　免疫組織化學(xué)檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)SP三步法對(duì)組織石蠟切片進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)步驟如下：切取4 μm石蠟切片烤片后二甲苯、酒精梯度下行脫蠟，3%雙氧水去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，抗原修復(fù)后滴加正常山羊非免疫血清封閉抗原，滴加Trx和TrxR1一抗，陰性對(duì)照切片滴加PBS，用作代替一抗，用乳腺癌石蠟切片作為陽(yáng)性對(duì)照。滴加生物素標(biāo)記工作液孵育，洗片后滴加鏈霉素抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精依梯度上行脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4　結(jié)果判定

染色后的組織切片通過(guò)Olympus顯微鏡采集圖片，經(jīng)有長(zhǎng)期組織病理學(xué)研究經(jīng)驗(yàn)的研究員對(duì)圖片進(jìn)行篩選，確定舌鱗狀細(xì)胞癌和癌旁正常上皮組織的組織學(xué)特性，使用Image Pro Plus 6.0(IPP 6.0 )軟件對(duì)圖片進(jìn)行光密度值檢測(cè)，記錄陽(yáng)性面積(area)和平均光密度(mean density)，單個(gè)標(biāo)本的陽(yáng)性指標(biāo)用累計(jì)光密度值(integrated optical density，IOD)判定，IOD=陽(yáng)性面積×平均光密度(如圖1)。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，計(jì)量資料間的差異采用單因素方差分析。應(yīng)用Kaplan-Meier和Log Rank檢驗(yàn)檢測(cè)Trx和TrxR1的表達(dá)量與患者生存狀況的關(guān)系。用Pearson相關(guān)系數(shù)檢測(cè)Trx和TrxR1在舌鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，以0.8～1.0為極強(qiáng)相關(guān)、0.6～0.8為強(qiáng)相關(guān)、0.4～0.6為中等程度相關(guān)、0.2～0.4為弱相關(guān)、0.0～0.2為極弱相關(guān)或無(wú)相關(guān)；α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1　Trx和TrxR1在TSCC和癌旁正常組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果如圖2顯示，Trx和TrxR1的陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核及胞質(zhì)中，呈黃色或棕黃色點(diǎn)狀或彌漫分布。Trx和TrxR1在正常癌旁組織中檢出的IOD值為(3.91±3.00)×107和(0.69±0.32)×107，而在TSCC組織中IOD值分別為(2.84±0.34)×108和(1.88±0.29)×108，顯著高于正常癌旁組織(p＜0.05或p＜0.01)。

2.2　Trx和TrxR1表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征之間的關(guān)系

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Trx的表達(dá)在腫瘤直徑≤2 cm和＞4 cm兩組間、分化程度好和差之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；TrxR1的表達(dá)在不同年齡、臨床分期、腫瘤直徑、分化程度之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜ 0.05或p＜ 0.01)，見(jiàn)表1。

圖1　應(yīng)用IPP軟件選取表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域

圖2　Trx和TrxR1在不同分化程度的舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

2.3　Trx和TrxR1之間表達(dá)的相關(guān)性分析

通過(guò)Pearson相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性回歸分析Trx和TrxR1之間表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者之間存在中等程度的正相關(guān)關(guān)系(r=0.504，P=0.006)，見(jiàn)圖3。

表1　舌鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征與Trx、TrxR1表達(dá)的關(guān)系

圖3　Trx和TrxR1之間表達(dá)的相關(guān)性分析

2.4　Trx和TrxR1表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌患者生存率的關(guān)系

我們對(duì)舌鱗癌患者進(jìn)行了隨訪(fǎng)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Trx和TrxR1高表達(dá)組與低表達(dá)組生存率間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)，見(jiàn)圖4。

A：Trx高表達(dá)組與低表達(dá)組生存率分析；B：TrxR1高表達(dá)組與低表達(dá)組生存率分析.

3　討論

口腔惡性腫瘤中，舌鱗狀細(xì)胞癌最為多見(jiàn)，每年造成約14.5萬(wàn)人死亡[6]，臨床因素是評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一，如是否有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡等，已有的研究發(fā)現(xiàn)小于40歲者較多出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且預(yù)后較差[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白(Trx)系統(tǒng)蛋白在胃癌、宮頸癌、乳腺癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的惡性程度相關(guān)，下調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10-12]。我們?cè)噲D探索Trx和TrxR1蛋白在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理特征的關(guān)系。

結(jié)果顯示，Trx和TrxR1相較于癌旁正常組織，在TSCC組織中顯著高表達(dá)，并在不同分化程度的TSCC組織中高度表達(dá)。Peng等[13]研究表明TrxR1在胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中過(guò)度表達(dá)。Hasan等[14]采用RT-PCR、免疫組化染色檢測(cè)TrxR1在腦膜瘤細(xì)胞和組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常腦膜組織和細(xì)胞相比，TrxR1表現(xiàn)出高表達(dá)并隨腫瘤等級(jí)增強(qiáng)而增加。這些結(jié)果均顯示，TrxR1 在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并且隨腫瘤病理級(jí)別升高而升高，同時(shí)在正常組織中呈現(xiàn)較低的表達(dá)水平，其具有較好的表達(dá)特異性。朱曉杰等[15]研究證實(shí)Trx和TrxR1在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于正常人群頰黏膜上皮組織，我們的研究結(jié)果顯示Trx和TrxR1 在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，正常癌旁組織中低表達(dá)，綜上結(jié)果說(shuō)明Trx和TrxR1在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中也具有上述表達(dá)特異性，可作為較好的藥物靶點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道Trx和TrxR1的表達(dá)程度與年齡、病理分級(jí)、有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤大小等臨床病理特征顯著相關(guān)，預(yù)示腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，Trx和TrxR1蛋白在不同腫瘤大小、病理分化程度之間表達(dá)存在差異；且TrxR1的表達(dá)在不同年齡、臨床分期組間亦存在差異，提示Trx和TrxR1的高表達(dá)影響著舌鱗狀細(xì)胞癌的形成與進(jìn)展。Trx自身的功能受TrxR1調(diào)控，我們使用Pearson相關(guān)系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)Trx與TrxR1表達(dá)呈中等程度正相關(guān)(r=0.504，p＜0.05)，提示Trx與TrxR1在舌鱗狀細(xì)胞癌形成和進(jìn)展過(guò)程中起著協(xié)同作用，其共同調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)可保護(hù)細(xì)胞存活[19]。參照于萍等[20]對(duì)計(jì)算機(jī)圖像分析進(jìn)行等級(jí)劃分的方法，我們根據(jù)測(cè)得免疫組化的IOD值(10倍鏡)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量介于1.0×107和1.0×109之間，故我們將≥1.0×108分為高表達(dá)組，＜1.0×108分為低表達(dá)組，分組后通過(guò)單因素方差分析結(jié)果顯示兩組的IOD值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌患者進(jìn)行隨訪(fǎng)的結(jié)果顯示，Trx與TrxR1高表達(dá)組和低表達(dá)組患者生存率存在顯著差異，提示Trx和TrxR1的過(guò)表達(dá)可能與舌鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后有關(guān)，目前已有研究報(bào)道將血漿作為樣本進(jìn)行Trx和TrxR1檢測(cè)可作為新型腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于腫瘤診斷[21-22]。

根據(jù)以上研究結(jié)果表明，Trx和TrxR1具有在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中過(guò)表達(dá)的特性，并且與臨床病理特征、生存率相關(guān)，其可作為藥物治療靶點(diǎn)和早期診斷、腫瘤篩查的重要臨床指標(biāo)應(yīng)用舌鱗狀細(xì)胞癌的診斷與治療。

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