黎青葉，柳曉玲，吳小嫩，郭 　萍 ，陳 　雯，陳麗萍*

（中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，廣東　廣州　510080）

2014年世界癌癥報告顯示，全球每年癌癥新發(fā)病例約1 400萬，死亡約800萬，其中肝癌和肺癌的發(fā)病率在全球高居前3位；在肝、食道、胃和肺4種臟器的惡性腫瘤中，中國新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位[1]。腫瘤的形成和發(fā)展是多階段、多因素的過程，其中涉及癌基因的激活和抑癌基因的失活，以及遺傳和表觀遺傳機制的異常[2]。表觀遺傳是指不涉及DNA序列改變，而在基因表達層面上發(fā)生了可遺傳的改變，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA[3]。近來腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)的組蛋白修飾日益受到表觀遺傳學(xué)研究學(xué)者的重視，且越來越多的結(jié)果表明組蛋白修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[4-5]。

組蛋白H3磷酸化作為有絲分裂的中期相標(biāo)志，在G1期調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性，在G2/M期可影響染色質(zhì)凝集[6]，具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)、細胞分化和凋亡等功能[7-8]。其中，組蛋白H3絲氨酸10位的磷酸化修飾[H3(Ser10)]與細胞周期及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等密切相關(guān)，以往研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H3(Ser10)磷酸化作為Aurora B激酶高表達的結(jié)果可能參與致癌過程[9]；也可通過調(diào)節(jié)14-3-3ζ蛋白、絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP1)、絲裂原和應(yīng)激激活蛋白激酶1(MSK1)的表達，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[10]。多種腫瘤促進因子如表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)誘導(dǎo)組蛋白H3(Ser10)的磷酸化進而激活轉(zhuǎn)錄因子連接蛋白1(adaptor protein 1，AP-1)[11]、鎘通過下調(diào)載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)[12]或 改變細胞周期[13]等，在細胞惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。然而，目前對于組蛋白H3(Ser10)磷酸化參與惡性腫瘤細胞表型維持或腫瘤形成的機制仍不明確。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，在化學(xué)致癌物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細胞模型和腫瘤中，蛋白磷酸酶2A(PP2A)的調(diào)控蛋白α4呈高表達[14]?；谝陨嫌嘘P(guān)組蛋白H3(Ser10)磷酸化的研究，本文擬探討組蛋白H3(Ser10)磷酸化在維持腫瘤細胞惡性表型中的作用，并通過α4的表達調(diào)控來闡明H3(Ser10)磷酸化在其中的可能機制。

1　材料與方法

1.1　主要試劑

DMEM和RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、100×青/鏈霉素、胎牛血清均購于美國Gibco公司；胰蛋白酶購于美國Amresco公司。兔抗人組蛋白H3及Ser10磷酸化多克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，兔抗人IGBP1多克隆抗體購于美國Novus Biologicals公司，熒光標(biāo)記抗兔二抗購于美國Thermo Fisher Scientific公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠及兔IgG(二抗)購于美國Santa Cruz公司。胸苷(Thymidine)、諾卡達唑(Nocodazole)均購自美國Sigma公司；碘化丙啶(PI)、DAPI購于上海碧云天公司；甲醛、乙醇、氯化鎘(CdCl2)均購于廣州化學(xué)試劑公司；雙熒光素酶報告檢測試劑盒購于美國Promega公司。

1.2　主要儀器

電泳儀、電泳槽和轉(zhuǎn)膜儀均購于美國Life公司；倒置顯微鏡購于日本Nikon公司；流式細胞儀購于美國Beckman Coulter公司。

1.3　質(zhì)粒構(gòu)建

利用質(zhì)粒擴增突變試劑盒(Stratagene，美國)構(gòu)建組蛋白H3(Ser10)位點突變質(zhì)粒(pBABE-HAH3S10A)。另外以人cDNA為模板，用高保真PCR酶(Thermo Scientific，美國)擴增得到HA-AP1產(chǎn)物后進行凝膠回收，經(jīng)酶切后裝載至pBABE-puro質(zhì)粒中，構(gòu)建AP-1 過表達質(zhì)粒(pBABE-HA-AP1)。α4啟動子質(zhì)粒(p G L 3-α 4)人 α 4啟 動 子 片 段 從 h t t p://switchgeargenomics.com獲取，設(shè)計引物擴增后酶切插入pGL3-MCS-control質(zhì)粒(中山大學(xué)生命科學(xué)院莊詩美教授饋贈)，所有質(zhì)粒經(jīng)測序確認。

1.4　細胞培養(yǎng)

人肝正常細胞株L02來自深圳疾病預(yù)防控制中心，人肝癌細胞株Bel7402、HepG2、SMMC-7721和人肺癌細胞株A549來自廣州市疾病預(yù)防控制中心毒理科。L02、Bel7402、HepG2、SMMC-7721和A549細胞培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，置于CO2體積分數(shù)為5%、37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，待細胞生長至匯合度約為80%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.5　構(gòu)建組蛋白H3(Ser10)位點突變和AP-1過表達的細胞株

pBABE-HA-H3S10A或pBABE-HA-AP1質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒pCL-ampho按1∶1比例經(jīng)磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293FT細胞，產(chǎn)生的病毒經(jīng)過濾后感染靶細胞Bel7402和A549，經(jīng)嘌呤霉素(1 μg/mL)篩選獲得陽性細胞，并經(jīng)免疫印跡驗證目的基因或標(biāo)簽蛋白HA的表達。

1.6　流式細胞術(shù)檢測細胞周期

將細胞按每孔1×105～5×105個細胞接種到6 cm培養(yǎng)皿，貼壁24 h后，待細胞生長至匯合度70%～80%時，采用胸苷嘧啶核苷雙阻斷法的處理組，在細胞培養(yǎng)基中加入2 mmol/L胸苷處理24 h，使細胞處于G1/S期；采用諾考達唑阻抑法的處理組，用100 ng/mL諾考達唑處理24 h使細胞處于G2/M期；對照組不做任何處理。周期阻滯后，消化收集細胞，離心收集的細胞用預(yù)冷PBS洗1次，再重懸于500 μL PBS，輕柔震蕩，并逐滴添加1.5 mL預(yù)冷的純乙醇，置-20 ℃過夜(至少12 h)；上機前在4 ℃，600 g離心10 min處理樣品，然后用冰PBS洗1次，靜置5 min后再次離心，重懸于300～500 μL的PI/Triton X-100染色液中，37 ℃孵育15 min，后經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾到流式管中，置冰上避光，24 h后用流式細胞儀進行檢測；檢測結(jié)果用Flowjo 7.6軟件擬合分析。實驗重復(fù)3次。

1.7　免疫熒光檢測磷酸化H3(Ser10)的表達

將L02細胞按每孔1×104個接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后用周期藥物阻滯(如1.6中所述)。分別收集對照組、胸苷處理組和諾考達唑處理組的細胞，棄培養(yǎng)基，用預(yù)溫的PBS洗3次，然后用3.7%的甲醛(用37 ℃預(yù)熱PBS配制)室溫固定15 min；去除固定液，加入PBS 輕柔搖動3 min，重復(fù)3次，然后加入含有0.1% Triton X-100的通透液(PBS配制)室溫通透5 min。吸走通透液后再用PBS洗3次，加入封閉液(含3% FBS的PBS)，在37℃封閉30 min。封閉結(jié)束后，加入用封閉液稀釋好的一抗p-H3(Ser10)(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日用PBS洗3次，每次5 min，加入熒光標(biāo)記Rabbit二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h。二抗孵育結(jié)束后，用PBS洗3次，再用DAPI(1∶1 000)襯染細胞核5 min，PBS洗1次，在免疫熒光顯微鏡下觀察，并拍照記錄。實驗重復(fù)3次。

1.8　蛋白印跡檢測H3(Ser10)磷酸化水平改變對α4表達的影響

按上述方法用100 ng/mL諾考達唑?qū)⑷苏８渭毎闘02和肝癌細胞株HepG2、Bel7402、SMMC-7721阻滯在M2期。收集細胞后使用SDS上樣緩沖液直接裂解法獲得細胞總蛋白，并使用細胞破碎儀(功率30%，超聲5 s，停頓1 s)處理樣品，8%～16%梯度膠分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法進行轉(zhuǎn)膜。5%的脫脂牛奶封閉1 h，然后分別加入兔抗人抗體α4(1∶5 000)、p-H3(Ser10)(1∶1 000)4℃孵育過夜，次日用PBS/T洗3次，每次5 min，再置于含山羊抗兔IgG HRP(1∶10 000)，室溫孵育1 h。加上ECL發(fā)光劑進入暗室使用X光膠片曝光成像。實驗重復(fù)3次。

1.9　軟瓊脂試驗檢測腫瘤細胞克隆形成能力

構(gòu)建p-H3(Ser10)低表達的Bel-H3S10A(S10A)細胞株，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的Bel-Vector(AP-1)細胞株為對照。使用DMEM培養(yǎng)基配置底層瓊脂(含0.6%瓊脂、10%胎牛血清、1%青/鏈霉素、1%兩性霉素B)鋪于6孔板冷卻備用。消化細胞并計數(shù)，按每孔2×104個細胞的密度混懸于頂層瓊脂(含0.4%瓊脂、10%胎牛血清、1%青/鏈霉素、1%兩性霉素B)中，鋪于底層瓊脂上，冷卻凝固后置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)21 d后，顯微鏡下觀察克隆并計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.1　0 雙熒光素酶報告試驗檢測p-H3(Ser10)對α4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

將A549細胞按每孔1×104個的密度接種于96 孔板，貼壁24 h后，按說明書使用Lipofectamine?2000 轉(zhuǎn)染試劑進行pGL3-α4及對照質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，48 h后用20 μmol/L氯化鎘染毒，12 h后使用熒光素酶報告試劑盒上機檢測并記錄數(shù)據(jù)。每個樣品做3個重復(fù)孔，取均值；以質(zhì)粒pRL-TK海腎光的讀取值為內(nèi)參，計算得到結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

1.1　1 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0及Graph-pad Prism- 5.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理和分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料采用x±s表示，多組間比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　磷酸化修飾的組蛋白H3(Ser10)在細胞中呈周期性表達

組蛋白H3磷酸化修飾具有周期性，且是細胞有絲分裂中期標(biāo)志[15]，因此首先對L02細胞進行了細胞周期阻滯來檢測p-H3(Ser10)的表達。如圖1A所示，L02細胞經(jīng)2 mmol/L胸苷處理24 h(T)后，大多數(shù)細胞處于G1和S期，而經(jīng)100 ng/mL諾考達唑處理24 h(N)后則處于G2/M期。免疫熒光和免疫印跡結(jié)果顯示(1B和1C)，與未處理組相比，p-H3(Ser10)表達水平在胸苷處理后明顯下降達71%(p＜0.05)，幾乎無表達，而在諾考達唑處理后表達明顯增加，為對照組的3.3倍(p＜0.05)。表明，p-H3(Ser10)在細胞中呈周期性表達，且在細胞分裂中期達到最高值。

2.2　磷酸化組蛋白H3(Ser10)在腫瘤細胞中的表達及功能

圖1　p-H3(Ser10)的周期性表達

將細胞經(jīng)諾考達唑阻滯在M2期后，采用免疫印跡法檢測人正常肝細胞株及肝癌細胞株中p-H3(Ser10)的蛋白表達。結(jié)果如圖2A所示，與對照L02細胞相比，肝癌細胞株HepG2、Bel7402、SMMC-7721中的p-H3(Ser10)水平升高了(2.61±0.45)倍(p＜0.05)，但總的組蛋白水平未見明顯改變，提示p-H3(Ser10)高表達在腫瘤發(fā)生過程中起作用。為驗證p-H3(Ser10)在腫瘤中的作用，我們進一步通過對Ser10位點進行突變(絲氨酸突變?yōu)楸彼?，構(gòu)建了p-H3(Ser10)低表達的Bel-H3S10A細胞株，并對該細胞株的惡性轉(zhuǎn)化功能進行檢測。如圖2B所示，Ser10位點突變引起的p-H3(Ser10)水平下降，使Bel7402腫瘤細胞株在軟瓊脂上形成的克隆數(shù)目減少30%(p＜0.05)，表明p-H3(Ser10)在維持腫瘤細胞惡性表型具有重要作用。

圖2　p-H3(Ser10)在腫瘤細胞中的表達及功能

2.3　鎘誘導(dǎo)組蛋白H3(Ser10)磷酸化修飾增加

進一步探討p-H3S10過表達參與腫瘤發(fā)生的可能機制。和前期實驗室結(jié)果一致[14]，圖2A所示，在癌細胞株中除p-H3(Ser10)高表達外，還觀察到蛋白磷酸酶2A(PP2A)的調(diào)控因子α4的高表達，進一步用氯化鎘處理A549細胞。免疫印跡結(jié)果如圖3所示，在不同濃度的氯化鎘(0、10、20和40 μmol/L)處理后，隨著氯化鎘濃度的增高，p-H3(Ser10)的表達水平明顯增加，20和40 μmol/L的濃度處理下分別上升了57%和142%(p＜0.05)，且具有劑量-反應(yīng)關(guān)系，但總的組蛋白表達水平未見明顯改變；同時α4的表達也隨著濃度增高而明顯增加，分別是對照組的1.41、2.80和2.84倍(p＜0.05)。在p-H3(Ser10)誘導(dǎo)激活表達的同時也觀察到α4的表達增加，因此我們推測在癌細胞中p-H3(Ser10)可能參與調(diào)控α4的表達。

2.4　組蛋白H3(Ser10)磷酸化調(diào)控α4的表達

圖3　不同濃度鎘誘導(dǎo)p-H3(Ser10)和α4表達增加

以往研究表明組蛋白磷酸化可激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1對靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[16]，且通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測，α4啟動子區(qū)有多個AP-1的結(jié)合位點(圖4A)。為驗證p-H3(Ser10)是否通過AP-1調(diào)控α4的表達，我們在A549細胞中構(gòu)建高表達AP-1同時H3(Ser10)位點突變的細胞株A549-AP1-Vector(AP1)和A549-AP1-H3S10A(S10A)。 用20 μmol/L的氯化鎘染毒后，檢測α4的表達水平。如圖4B所示，雙熒光素酶報告試驗結(jié)果顯示，AP1細胞經(jīng)鎘處理后，AP-1的轉(zhuǎn)錄活性升高了80%(p＜0.05)；經(jīng)鎘處理后，p-H3(Ser10)低水平表達的S10A細胞株中AP-1的轉(zhuǎn)錄活性升高幅度比AP1細胞下降了30%(p＜0.05)。一致的是，蛋白印跡結(jié)果也顯示(圖4C)，在鎘作用下，與高表達AP-1的對照細胞AP1相比，組蛋白H3(Ser10)位點突變株S10A細胞中，p-H3 (Ser10)的表達水平降低51%，同時檢測到S10A細胞中的α4蛋白表達較對照細胞株下降47%(p＜0.05)，但總的組蛋白表達水平未見明顯改變。以上結(jié)果提示p-H3(Ser10)可通過激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1調(diào)控α4的表達。

圖4　p-H3(Ser10)調(diào)控α4的表達

3　討論

組蛋白修飾在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細胞內(nèi)基因的表達，單個基因位點或全基因組中組蛋白修飾調(diào)節(jié)模式的紊亂會導(dǎo)致腫瘤的形成[17]。本研究發(fā)現(xiàn)H3(Ser10)的磷酸化水平在肝癌細胞株中升高，推測高水平磷酸化修飾的H3(Ser10)具有癌基因功能，而進一步的功能實驗則發(fā)現(xiàn)p-H3(Ser10)可通過激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1調(diào)控α4的表達來參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們的研究揭示了一條組蛋白異常修飾參與腫瘤發(fā)生過程的新信號通路。

以往研究發(fā)現(xiàn)H3(Ser10)的磷酸化水平在有絲分裂原和癌基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的小鼠成纖維母細胞中是增加的[18]，并參與EB病毒潛在膜蛋白-1(LMP1)誘導(dǎo)的鼻咽癌形成過程[19]。相一致的是，我們也發(fā)現(xiàn)全基因組水平的組蛋白H3磷酸化修飾表達升高，這與組蛋白H3(Ser10)位磷酸化水平在以上腫瘤中升高的報道是一致的，證實其很可能參與了腫瘤形成的過程。此外，也有研究證實H3(Ser10)的磷酸化修飾與快速反應(yīng)基因(immediate-early gene，IE)相關(guān)，包括原癌基因c-fos和c-jun[20]。IE基因反應(yīng)在分化、有絲分裂、疾病如癲癇和癌癥過程中發(fā)揮作用[21-22]。

本研究發(fā)現(xiàn)H3(Ser10)的磷酸化水平隨著細胞周期呈現(xiàn)規(guī)律性變化，這和以往的研究一致[23]。H3(Ser10)的磷酸化水平在癌細胞株中升高，也在可誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化的化學(xué)致癌物氯化鎘誘導(dǎo)下升高，這與α4的表達相似且趨勢一致。我們之前發(fā)現(xiàn)PP2A的調(diào)節(jié)蛋白α4在人惡性細胞轉(zhuǎn)化過程中起著重要的調(diào)控作用，α4在轉(zhuǎn)化細胞中表達顯著上調(diào)并且在肺腺癌組織中呈高表達水平。本研究中α4在肝癌細胞株HepG2、Bel7402、SMMC-7721中的表達水平較L02細胞均顯著升高，且氯化鎘染毒處理也可以誘導(dǎo)α4的表達上調(diào)，進一步支持了α4在化學(xué)致癌和惡性轉(zhuǎn)化表型中的重要作用。α4基因啟動子存在轉(zhuǎn)錄因子AP-1的調(diào)控區(qū)域，我們構(gòu)建了高表達AP-1同時H3(Ser10)位點突變的細胞株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子AP-1對α4的表達調(diào)控作用減弱，與高表達AP-1的對照細胞相比，H3(Ser10)位點突變細胞的p-H3 (Ser10)和α4表達水平均下降近50%；且在細胞受到致癌化學(xué)物氯化鎘的刺激下，低表達p-H3(Ser10)細胞的α4表達升高幅度比對照細胞下降近50%，說明p-H3(Ser10)可通過激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1調(diào)控α4的表達，提示組蛋白H3(Ser10)磷酸化參與了化學(xué)物致癌過程中α4的調(diào)控通路。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)組蛋白H3(Ser10)磷酸化修飾在肝腫瘤細胞中呈過表達水平，且在化學(xué)致癌物誘導(dǎo)過程中顯著上調(diào)，提示組蛋白H3(Ser10)參與腫瘤細胞維持惡性表型的過程，其機制可能是組蛋白H3(Ser10)通過轉(zhuǎn)錄因子AP-1調(diào)控促癌因子α4的表達。因此，我們認為組蛋白H3(Ser10)磷酸化有望作為癌癥治療的一個新靶點。

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