左 　然 任曉虎 吳德生李 　萍 吳 　雯 謝 　妮袁建輝* 讓蔚清*

（1．南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南　衡陽　421001；2．深圳市疾病預(yù)防控制中心毒理研究所，廣東 　深 圳 　518055；3．深圳市第二人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，廣東 　深 圳 　518000）

乳腺癌是全世界女性最常見的侵襲性腫瘤之一，其發(fā)病率高居女性腫瘤榜首，對女性健康造成極大威脅[1-2]。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，遺傳、雌激素水平、生長因子、細(xì)胞因子、激酶和非編碼RNA等均在腫瘤細(xì)胞生長中起重要作用[3-4]。microRNA是一類重要的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[5]。microRNA和表觀遺傳調(diào)控過程之間存在復(fù)雜的反饋網(wǎng)絡(luò)并形成表觀遺傳學(xué)microRNA調(diào)控回路[6]。隨著對microRNA功能研究的不斷涌現(xiàn)，越來越多的研究表明microRNA與腫瘤之間存在密切關(guān)系。有報道發(fā)現(xiàn)，microRNA-214-3p通過抑制靶基因MELK表達(dá)從而抑制肝細(xì)胞癌進(jìn)展[7]；而miR-137下調(diào)和肝癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被發(fā)現(xiàn)與不良預(yù)后密切相關(guān)[8]；另外microRNA-200可影響管腔祖細(xì)胞增殖進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移[9]。盡管microRNA及其潛在靶向調(diào)控的基因已被廣泛應(yīng)用于腫瘤研究，但類似的分子事件在乳腺癌預(yù)后中鮮有涉及。本研究通過挖掘腫瘤基因組圖譜計劃(the cancer genome atlas，TCGA)中的乳腺癌基因表達(dá)譜和microRNA測序數(shù)據(jù)，尋找乳腺癌預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵性分子事件。

本研究中，我們利用van Iterson等[10]提出的全局算法整合基因表達(dá)譜和microRNA測序數(shù)據(jù)，并預(yù)測給定臨床背景下的microRNA靶基因。該算法用到的統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)可以評估Pearson相關(guān)系數(shù)出現(xiàn)假陽性的情況，同時基于全局檢驗(yàn)通過Lasso回歸預(yù)測數(shù)據(jù)庫中所有可能的目標(biāo)mRNA[11-12]。為了進(jìn)一步分析microRNA及相關(guān)靶基因在乳腺癌中起到的作用，我們利用通用基因集富集算法(general applicable gene set enrichment，GAGE)[13]分析microRNA及其靶基因涉及的異常變化通路。進(jìn)一步證實(shí)所篩選的microRNA在乳腺癌組織和細(xì)胞中能負(fù)向調(diào)節(jié)其靶基因，并使用Cox回歸風(fēng)險模型比例風(fēng)險模型評估其作為預(yù)后標(biāo)志物的潛力。本研究分別對乳腺癌相關(guān)microRNAs和基因的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1　材料與方法

1.1　數(shù)據(jù)準(zhǔn)備

從TCGA數(shù)據(jù)庫中(http://cancergenome.nih.gov/)下載經(jīng)Lowess標(biāo)準(zhǔn)化和對數(shù)轉(zhuǎn)化的乳腺癌3級基因表達(dá)數(shù)據(jù)和microRNA測序數(shù)據(jù)。將所有的基因符號轉(zhuǎn)換為Entrez Gene ID后，整理成矩陣并導(dǎo)入結(jié)構(gòu)調(diào)查語言(structure query language，SQL)數(shù)據(jù)庫中。

1.2　乳腺癌中的基因與microRNA表達(dá)的定量分析

將來自120對癌-癌旁組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)以及204對癌-癌旁組織的microRNA測序數(shù)據(jù)整理、優(yōu)化后，利用R語言Limma軟件包(Limma package R 3.1.1)通過整合線性模型、經(jīng)驗(yàn)貝葉斯理論與傳統(tǒng)t檢驗(yàn)對基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定量及統(tǒng)計分析。利用Holm-Bonferroni方法控制多次統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)可能產(chǎn)生的假陽性，將假陽性率(false discovery rate，F(xiàn)DR)控制在0.01。差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：FDR值(即矯正后的P值)小于0.01，差異表達(dá)絕對值變化大于4。對于異常改變的microRNA，篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR值(即矯正后的P值)小于0.01，差異表達(dá)絕對值變化大于1.5[14-15]。

1.3　乳腺癌中microRNAs潛在調(diào)控靶基因的預(yù)測

收集388例乳腺癌和388例配對癌旁組織的基因表達(dá)譜和microRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。從miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)，MSigDBC3 motif Gene set(http://www.broadinstitute.org/)，PITA(http://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_data.html)，Microcosm(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/) 數(shù)據(jù)庫獲得microRNA靶基因。將來自388名患者基因譜表達(dá)數(shù)據(jù)和microRNA測序數(shù)據(jù)整理為矩陣格式。利用van Iterson等提出的基于線性(或廣義線性)回歸模型的全局無效假設(shè)的microRNA靶基因預(yù)測算法分析microRNA的潛在靶基因，該方法旨在提供一種有效的方法來評估多種疾病之間的定量比較，并預(yù)測每個潛在的microRNA-mRNA的關(guān)聯(lián)性[10]。該算法在R軟件microRNA-mRNA包中實(shí)現(xiàn)(http://www.humgen.nl/Microarray Analysis Group.html)。選擇同時在2個或以上數(shù)據(jù)庫中預(yù)測到的microRNA靶基因作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫。將樣本隨機(jī)分為訓(xùn)練集(所有樣品的2/3)和測試集(所有樣品的1/3)，把microRNA預(yù)測靶基因?qū)σ刖€性回歸模型的全局無效假設(shè)方法應(yīng)用于訓(xùn)練集，找出關(guān)聯(lián)并在測試集中進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4　基因集富集分析

傳統(tǒng)定量分析關(guān)注單個基因顯著變化卻忽視了多個基因之間的協(xié)同作用，因此通用基因集富集算法(GAGE)是對特定基因集合(如特定信號通路)的變化進(jìn)行分析，而不考慮單個基因改變。將基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)整理成矩陣(基因表達(dá)為行，樣本分組為列)導(dǎo)入R軟件，通過GAGE包進(jìn)行分析。基因集來自MSigDB C2 Curated Gene set(http://www.broadinstitute.org/)。不同于傳統(tǒng)的基因集富集，GAGE算法允許基因同時向不同方向(上調(diào)或下調(diào))變化，因此更適合于通路分析。Benjamini和Hochberg方法來控制多重測試的假陽性率，選擇校正后的P值(即Q值)＜0.05基因集進(jìn)一步分析。基因集的大小(包括在基因集中的基因的數(shù)目)設(shè)定在50～500個之間，選擇差異變化大于1倍標(biāo)準(zhǔn)差的基因集。

1.5　Cox回歸風(fēng)險模型篩選乳腺癌潛在評估預(yù)后的分子靶標(biāo)基因

利用R survival包(R package survival)分析microRNA及潛在靶基因在乳腺癌預(yù)后中的作用。以microRNA測序數(shù)據(jù)及基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)作為主要自變量，生存時間為因變量，相關(guān)臨床資料作為次要自變量，使用Cox回歸風(fēng)險模型進(jìn)行迭代分析，Kaplan-Meier進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1　乳腺癌中異常表達(dá)的基因和microRNA

對基因表達(dá)譜和microRNA測序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示，17 533個基因中只有344個基因表達(dá)呈顯著改變(矯正后p＜0.01，差異表達(dá)絕對值變化大于4)，見圖1A和表1。而microRNA中，135個在乳腺癌組織中表達(dá)發(fā)生異常改變化(矯正后p＜0.01，差異表達(dá)絕對值變化大于1.5)，見圖1B和表2。

圖1　mRNA和microRNA表達(dá)譜的火山圖

表1　microRNA及其潛在靶基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證

2.2　乳腺癌中基于表達(dá)數(shù)據(jù)的microRNAs潛在靶基因預(yù)測

對338對乳腺癌-癌旁組織的microRNA及基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究發(fā)現(xiàn)，31個microRNA與6 429個預(yù)測靶基因顯著相關(guān)。其中有部分microRNA對基因表達(dá)呈正相關(guān)，盡管研究報道發(fā)現(xiàn)microRNA可誘導(dǎo)上調(diào)靶mRNA對細(xì)胞周期阻滯[16-17]，亦可促進(jìn)結(jié)合核糖體mRNA基因的5′UTR和增強(qiáng)翻譯[18]，但目前尚無證據(jù)表明在人群中microRNA上調(diào)能引起mRNA表達(dá)增加，因此正相關(guān)可能由于microRNA對基因的間接調(diào)控作用。然而為保證結(jié)果的可靠性，我們僅選擇與靶基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)的microRNA進(jìn)行驗(yàn)證。利用另外60對癌-癌旁的microRNA和基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，對14個microRNA和67個負(fù)相關(guān)的潛在靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，其中6個microRNA表達(dá)上調(diào)，其潛在靶基因表達(dá)下調(diào)，而8個microRNA表達(dá)下調(diào)，其潛在調(diào)控靶基因上調(diào)。

2.3　microRNA及其潛在調(diào)控靶基因的通路富集

為了進(jìn)一步探討microRNA及相關(guān)靶基因在乳腺癌中可能的作用機(jī)制，基因集富集算法對microRNA測序及基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)了8個乳腺癌相關(guān)microRNA及其調(diào)控的31個關(guān)鍵潛在調(diào)控靶基因參與139條乳腺癌富集通路(見圖2)。

表2　乳腺癌相關(guān)臨床資料的生存分析

2.4　乳腺癌潛在預(yù)后標(biāo)志物

生存曲線顯示，乳腺癌患者從初始診斷起的6年，生存率明顯下降(2 000 d，圖3A)。為避免樣本變異和未記錄樣本的選擇偏倚，選擇有完整記錄的樣本(有臨床結(jié)局和治療方案)進(jìn)行分析。由于某些類別的腫瘤分期(IV，Tis和X)樣本量非常少，因此未被納入生存分析。Cox回歸風(fēng)險模型顯示，腫瘤邊緣狀態(tài)、更年期狀態(tài)和淋巴結(jié)數(shù)量等相關(guān)臨床資料對患者預(yù)后無明顯影響。而放射治療顯示腫瘤邊緣狀態(tài)呈保護(hù)作用(HR=0.432，P=0.058，圖3B)。進(jìn)一步深入分析發(fā)現(xiàn)，分泌卷曲相關(guān)蛋白1(SFRP1)高表達(dá)呈保護(hù)作用(HR=0.9，P=0.015，圖3C)，has-miR-342-5p既沒有保護(hù)作用，也沒有危害效應(yīng)(HR=0.99，P=0.144，圖3D)。然而，交互作用研究顯示，has-miR-342-5p抑制靶基因SFRP1時提示不良預(yù)后(見表3)。另外，hasmiR-342-5p對生長特異型抑制基因2(GASP2)的抑制作用則代表不良預(yù)后(Cox多因素分析，P=0.016，HR=18.88)。

圖3　乳腺癌患者的生存曲線

表3　乳腺癌潛在預(yù)后標(biāo)志物

3　討論

在本研究中，我們將microRNA與其靶基因的關(guān)聯(lián)性研究與通路富集分析整合后篩選出有明顯改變的microRNAs及其潛在靶基因。此外，我們對所有預(yù)測的microRNA-靶基因中，發(fā)現(xiàn)9對microRNA-靶基因已在其他研究中被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(表1)。其中7個microRNA及其30個潛在靶基因被發(fā)現(xiàn)在139個乳腺癌異常通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Cox回歸風(fēng)險模型分析揭示了來自這些microRNA及其靶基因參與的分子事件可作為乳腺癌重要的預(yù)后特征。使用Cox比例風(fēng)險分析，SFRP1、CLDN19及KRT5在患者生存中被發(fā)現(xiàn)有保護(hù)作用。已知SFRP1是與乳腺癌細(xì)胞生長負(fù)相關(guān)的腫瘤抑制因子[19]。據(jù)報道，乳腺癌中SFRP1的失活與不良預(yù)后有關(guān)[20]。此外，SFRP1僅在2 400～3 500 d內(nèi)表示出顯著的危害效應(yīng)，而在3 500 d后危害效應(yīng)降低。然而，由于miR-342-5p的調(diào)節(jié)，SFRP1的保護(hù)作用受到了影響。

目前已有一些研究表明microRNA與乳腺癌的相關(guān)性，在乳腺癌的發(fā)生過程中起到促癌或抑癌的作用。miR-342-5p是一種多功能的microRNA，參與細(xì)胞增殖、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多重要的生物學(xué)過程。據(jù)報道m(xù)iR-342-5p在由MCF-7細(xì)胞構(gòu)成的三維組織模型中通過靶向DNA結(jié)合抑制劑4(ID4)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)來調(diào)節(jié)CEACAM1誘導(dǎo)的管腔形成[21]。此外，miR-342-5p還通過調(diào)節(jié)Notch信號傳導(dǎo)參與神經(jīng)元干細(xì)胞分化[22]，并可作為阿爾茨海默癥的潛在血漿生物標(biāo)志物[23]。其他研究表明，miR-342-5p可能通過下調(diào)阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因模型小鼠中的錨蛋白G來促成軸突病變[24]。

SFRP1是富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的SFRP家族成員，可能被Wnt結(jié)合。同時SFRP1還介導(dǎo)視網(wǎng)膜中感光細(xì)胞的極性[20]。CLDN19是一個重要的膜蛋白，在細(xì)胞間緊密連接中起關(guān)鍵作用[25]，CLDN19的異常表達(dá)可促進(jìn)癌前病變的細(xì)胞向惡性方向發(fā)展[26]。也有報道CLDN19 在乳腺癌中表達(dá)異常降低[27]，與我們的研究結(jié)果一致。

在乳腺癌中microRNA靶向調(diào)控特定基因作為預(yù)后關(guān)鍵分子事件的研究還相對較少。因此我們的研究不僅揭示了miR-342-5p、SFRP1、CLDN19以及KRT5在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中具有的重要生物學(xué)功能，同時還表明miR-342-5p可能通過抑制乳腺癌中的SFRP1、KRT5以及CLDN19來提示不良預(yù)后，這為miR-342-5p相關(guān)的分子事件作為乳腺癌臨床監(jiān)測的潛在指標(biāo)提供了科學(xué)依據(jù)。

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