童文艷，徐林娜，喬慧聰，李 芬

(河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007)

煙草H2A序列來(lái)自于以 NtTkr尾部為誘餌進(jìn)行的酵母雙雜交篩選，NtTkr與新發(fā)現(xiàn)的煙草驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員12(kinesin-12 subfamily)NtKrp序列一致，在分裂旺盛的組織和發(fā)育各時(shí)期胚中表達(dá)，可調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而影響胚、種子大小與萌發(fā)[1]。NtTkr有3個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，尾部卷曲螺旋中 1 084 位的 T 缺失或突變會(huì)影響其分布，而這一改變是受與其結(jié)合的蛋白底物的影響。已知驅(qū)動(dòng)蛋白是一類(lèi)蛋白質(zhì)超家族，屬于分子馬達(dá)的一種，其“頭部”具有ATP酶活性，能通過(guò)水解ATP獲得能量，在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行著多種功能[2]，如細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器及大分子沿微管的定向輸運(yùn)、核融合、細(xì)胞分裂過(guò)程中染色體的移動(dòng)、紡綞體的形成、神經(jīng)元的發(fā)育以及發(fā)育過(guò)程中成形素的分布等均與驅(qū)動(dòng)蛋白家族密切相關(guān)[3-4]。已知與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)直接相關(guān)的馬達(dá)蛋白有3種：驅(qū)動(dòng)蛋白、肌球蛋白、動(dòng)力蛋白，它們既負(fù)責(zé)真核細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，也參與胞內(nèi)物質(zhì)的定向運(yùn)輸、細(xì)胞分裂、形態(tài)建成等重要生物學(xué)過(guò)程，而這些功能都與其卷曲螺旋結(jié)構(gòu)有直接的關(guān)系。

NtTkr共有3個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，其中卷曲螺旋CC1和CC2形成莖桿結(jié)構(gòu)，尾部的CC3(1 049～1 143Aa)可能參與靶蛋白的相互作用。因?yàn)榻湍鸽p雜交分析發(fā)現(xiàn)缺失和替換1 084位T在酵母細(xì)胞中可影響NtTkr與候選蛋白的結(jié)合強(qiáng)度。

為進(jìn)一步檢測(cè) NtTkr全長(zhǎng)、尾部、T1084替換或缺失的尾部與候選蛋白之間的相互作用，筆者對(duì)H2A進(jìn)行了序列分析及蛋白結(jié)構(gòu)域分析，并將其克隆入pGEX4T-1 原核表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，為運(yùn)用Pull Down 驗(yàn)證其相互作用進(jìn)而確定NtTkr與底物互作的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒。以NtKkr 尾部為誘餌雙雜交獲得的陽(yáng)性克隆F35-1，大腸桿菌DH5α和BL21；PGEX-4T-1質(zhì)粒。

1.1.2工具酶與主要試劑。BamH I、XhoI 限制性?xún)?nèi)切酶和KOD-plus高保真酶，X-gal，IPTG，回收試劑盒，T4DNA 連接酶，RnaseA，dNTP 等均購(gòu)自ToYoBo公司。

1.2方法

1.2.1信息查詢(xún)。在美國(guó)國(guó)立生物信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)中，尋找與F35-1插入序列最為接近的核苷酸序列。

1.2.2同源性比較。運(yùn)用Bioedit軟件將F35-1插入序列與擬南芥H2A的Aa進(jìn)行同源性比較。

1.2.3蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析。利用EMBL的SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析。

1.2.4PCR片段的獲得。擴(kuò)增引物由 TaKaRa 生物工程公司合成，合成產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化，其序列如下：5’端引物為p1:5’-NNNNggATCCTCAACAACAGCAACCAAA-3’;3’端引物為 p2:5’- NNNNCTCgAgCTGAGAAATAGAGGCAA-3’。引物兩端分別加上BamH I 和XhoI 共2個(gè)酶切位點(diǎn)；以pGADT-Rec-F35-1質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增獲得目的片段。

1.2.5表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-H2A的構(gòu)建和鑒定。將pGEX-4T-1和PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和XhoI酶切、凝膠回收4 969 bp的pGEX-4T-1載體和414 bp 的目的片段，在T4DNA連接酶作用下16 ℃連接16 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α超感細(xì)胞，經(jīng)酶切鑒定篩選正確的重組質(zhì)粒 pGEX-4T-H2A，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2.6目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)。將測(cè)序無(wú)突變的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在50 mg/mL氨芐青霉素LB平板上挑取單克隆，37 ℃、180 r/min 過(guò)夜培養(yǎng)，次日1∶100稀釋菌液，培養(yǎng)4 h左右至OD600=0.8時(shí)，分別經(jīng)0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 mmol/L的IPTG 于37 ℃誘導(dǎo) 4 h 后, 取菌液2 mL，1 000 r/min、4 ℃離心1 min，棄上清，菌體中加入還原型2×SDS上樣緩沖液和去離子水各100 μL，混勻后煮沸 10 min，取15 μL 樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2　結(jié)果與分析

2.1H2A序列分析將以 NtKrp 尾部為誘餌進(jìn)行酵母雙雜交篩選得到的陽(yáng)性克隆 F35-1 測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其插入片段大小為610 bp，經(jīng)ORF finder 序列分析同時(shí)結(jié)合真核基因的特點(diǎn)可以確定該序列含有1個(gè)長(zhǎng)度為426 bp 的編碼框，編碼142個(gè)Aa 和1個(gè)終止密碼子。其序列如圖1所示。

通過(guò)Blast發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)35-1的核苷酸和氨基酸序列均與擬南芥的組蛋白H2A有很高的一致性，該基因的CDS全長(zhǎng)為426 bp，編碼142個(gè)氨基酸。二者的同源性比較見(jiàn)圖2，其氨基酸的一致性為74%，相似性為88%。蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白含H2A結(jié)構(gòu)域，參與組蛋白核心八聚體的組成，對(duì)應(yīng)核苷酸序列為煙草H2A的編碼基因。

圖1　H2A序列Fig.1　H2A sequence

注：F35-1為陽(yáng)性克隆基因； NP_172363.1為擬南芥組蛋白H2A基因；灰色為相似性；黑色為相同性Note：F35-1 was positive clone gene; NP_172363.1 was Arabidopsis histone H2A gene;Gray was similarity;Black was homogeny圖2　F35-1與擬南芥組蛋白H2A基因的氨基酸序列分析Fig.2　Amino acid sequence analysis of F35-1 and Arabidopsis histone H2A gene

2.2煙草H2A全長(zhǎng)的克隆、酶切與電泳回收以質(zhì)粒pGADT-Rec-F35-1為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖3)，得到414 bp的擴(kuò)增帶，與預(yù)期大小相符。運(yùn)用引入引物兩端的PCR產(chǎn)物，經(jīng)BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，電泳回收得到用于連接的H2A-414片段。

2.3原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切的pGEX-4T-1凝膠回收4 969 bp 載體片段，將其與“2.2”同樣雙酶切的H2A-414片段進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，得到4 969 bp的載體片段和414 pb的H2A全長(zhǎng)(圖4)，測(cè)序無(wú)突變，表明得到正確的原核表達(dá)載體pGEX-4T-H2A。

2.4H2A的誘導(dǎo)表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-H2A轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，轉(zhuǎn)化子經(jīng)0.10、 0.08、0.06、0.04、0.02 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后收集菌體，煮沸后經(jīng)12% SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明大于0.06 mmol/L IPTG濃度誘導(dǎo)后表達(dá)的蛋白量幾乎相當(dāng)，都可高效表達(dá)約38 kD的煙草H2A蛋白(圖5)。

注：1 .λ-Eco T14 Marker；2.PCR產(chǎn)物Note：1.λ-Eco T14 Marker；2.PCR products圖3　煙草H2A-414 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3　Agarose gel electrophoresis of tobacco H2A-414 PCR products

注：A.pGEX-4T-H2A的酶切鑒定(1.DL5000 Marker;2.pGEX-4T-H2A重組子BamH I和Xho I雙酶切后得到的4 969 bp的載體片段和414 bp的H2A全長(zhǎng))；B.pGEX-4T-H2A圖譜，示414 pb的H2A全長(zhǎng)插入pGEX-4T-1的酶切位點(diǎn)Note：A.Enzyme digestion identification of pGEX-4T-H2A(1 .DL5000 Marker ;2. 4 969 bp vector got by double enzyme digestion and 414 bp H2A overall length )；B. pGEX-4T-H2A atlas,enzyme digestion site of 414 bp H2A overall length inserted with pGEX-4T-1圖4　pGEX-4T-H2A重組子的酶切鑒定Fig.4　Enzyme digestion identification of pGEX-4T-H2A recombinant

注：1.蛋白分子量Marker：PageRuler Unstained Protein Lader；2.空載的表達(dá)； 3.IPTG誘導(dǎo)前H2A的表達(dá)；4～8.0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后H2A的蛋白表達(dá)Note：1.Protein marker：PageRuler Unstained Protein Lader;2.No-load expression;3.H2A expression before IPTG induction;4-8.H2A protein expression after induction with 0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 mmol/L IPTG圖5　煙草H2A的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.5　Induction expression of tobacco H2A

3　結(jié)論與討論

已知的植物Kinesin多在不同組織中廣泛表達(dá)[1-2,5]，煙草新KinesinNtTkr卻在幼葉和各發(fā)育時(shí)期的胚等分裂旺盛部位優(yōu)勢(shì)表達(dá)[1,6-7]。這種組織特異性表達(dá)模式提示它可能在胚胎發(fā)生及葉組織分化過(guò)程中具有獨(dú)特的作用。對(duì)于揭示未知蛋白的功能，篩選與之相互作用的蛋白質(zhì)非常重要，因?yàn)樯矬w中幾乎所有生物過(guò)程，如 DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，都離不開(kāi)蛋白質(zhì)之間的相互作用。通過(guò)對(duì)煙草幼葉 cDNA 文庫(kù)的酵母雙雜交篩選，得到了多個(gè)能與 NtTkr 互作的候選蛋白質(zhì)。由于酵母雙雜交具有局限性，不可避免地會(huì)存在假陽(yáng)性[8-10]，要確定候選蛋白是否真的能夠與目的蛋白發(fā)生作用，必須通過(guò) Pull Down 及 CoIP 或免疫共定位來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證[4,11-12]。故筆者以pGADT-Rec-F35-1質(zhì)粒為模板，PCR 擴(kuò)增煙草H2A全長(zhǎng)，并將其克隆入原核表達(dá)載體pGEX4T-1，轉(zhuǎn)入 BL21(DE3)，誘導(dǎo)其成功表達(dá)，為 Pull Down 驗(yàn)證該蛋白與候選蛋白之間的相互作用奠定了基礎(chǔ)。

重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-H2A構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21超級(jí)感受態(tài)，IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)。因目的蛋白的可溶性、穩(wěn)定性和表達(dá)量因蛋白而異，故必須依據(jù)實(shí)際情況調(diào)整誘導(dǎo)表達(dá)條件。要使蛋白達(dá)到較高表達(dá)量，除培養(yǎng)時(shí)間和溫度外，合適的IPTG工作濃度也極為重要。因此，筆者在相同溫度和時(shí)間條件下，設(shè)置5個(gè)IPTG濃度，蛋白電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，IPTG濃度為0.06 mmol/L時(shí)表達(dá)量較高，繼續(xù)增大濃度時(shí)與0.06 mmol/L誘導(dǎo)差別不大，表明IPTG工作最適濃度為0.06 mmol/L。

最近有報(bào)道表明NtKrp通過(guò)與核糖體蛋白NtRPL17相互作用，影響細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)而調(diào)節(jié)胚胎/種子大小和幼根生長(zhǎng)[13]。如能證實(shí)NtKrp與組蛋白H2A的相互作用可進(jìn)一步揭示NtKrp影響細(xì)胞分裂的機(jī)制。筆者構(gòu)建了煙草H2A基因全長(zhǎng)和pGEX4T-1載體大片段連接的融合表達(dá)載體并成功地誘導(dǎo)其表達(dá)，為深入研究NtTkr與候選蛋白質(zhì)之間的體外互作及該蛋白的其他生物學(xué)功能奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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