楊偉君，馬詩經(jīng)，焦春偉，楊詠善，陳家明，梁慧嘉，李良秋，謝意珍,**

（1.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070）

靈芝孢子（Ganoderma lucidumspore） 是靈芝成熟時(shí)從菌蓋中彈射出來的極微小部分，是靈芝的生殖細(xì)胞，具有靈芝全部的遺傳活性物質(zhì)[1]。靈芝孢子粉含有多糖類、三萜類、核苷類、甾醇類等活性物質(zhì)以及有機(jī)鍺和硒等多種礦物元素（如K、Mg、Ca、Mn、Fe、Mo）[2]，具有補(bǔ)氣安神、健脾益肺作用，臨床上用于調(diào)節(jié)免疫[3]、抗腫瘤[4]、調(diào)節(jié)血脂、降低血糖[5]、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)等[6]。近年來，靈芝栽培技術(shù)日趨成熟，靈芝孢子粉產(chǎn)量也逐步提高。國內(nèi)學(xué)者不斷深入研究靈芝孢子粉的活性成分和藥理作用，并以其為原料開發(fā)具調(diào)節(jié)免疫力等功能的保健食品。

目前，行業(yè)內(nèi)尚未制定靈芝孢子粉多糖含量檢測(cè)方法的國家標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定靈芝孢子粉多糖含量的方法主要有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，部分研究者對(duì)以上2種方法的適用性、局限性等進(jìn)行一些研究[7-8]，并發(fā)現(xiàn)苯酚-硫酸法在試驗(yàn)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性方面要優(yōu)于蒽酮-硫酸法[9-10]，由于苯酚-硫酸法所采用苯酚和濃硫酸試劑具有一定危害性，加之苯酚和硫酸的用量與多糖的組成結(jié)構(gòu)有關(guān)，過量的硫酸會(huì)造成顯色物質(zhì)的分解，影響測(cè)定結(jié)果[11-12]。因此，有必要對(duì)苯酚-硫酸法的檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。

本文在苯酚-硫酸法檢測(cè)條件的基礎(chǔ)上，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了苯酚、濃硫酸用量，以及提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度6個(gè)檢測(cè)條件對(duì)多糖含量的影響，確定了靈芝孢子粉多糖的最佳檢測(cè)條件，并分析了優(yōu)化后的檢測(cè)方法與現(xiàn)行的農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》的差異，優(yōu)化后的靈芝孢子粉多糖檢測(cè)方法能有效減少檢測(cè)試劑苯酚和濃硫酸的使用量，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

1　材料與方法

1.1　試劑與儀器

靈芝孢子粉，破壁處理，由廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司提供；無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇等，分析純，購于廣州化學(xué)試劑廠。

5840R離心機(jī)，Eppendorf公司；UV-1750紫外分光光度計(jì)，島津公司；DK-8D恒溫水浴鍋，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2　材料

1.2.1靈芝孢子粉多糖的制備

分別稱取2份靈芝孢子粉40 g，加蒸餾水400 mL，浸潤15 min，加熱回流提取3 h，提取2次，過濾，合并濾液，減壓濃縮至50 mL，經(jīng)噴霧干燥即得靈芝孢子粉多糖提取物。另一份濃縮液加入3倍體積的無水乙醇溶液，于4℃冰箱中靜置過夜，抽濾，依次用無水乙醇溶液、丙酮、乙醚洗滌沉淀2次～3次，60℃干燥，得靈芝孢子粉多糖。

1.2.2溶液的配制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密稱取105℃干燥恒重葡萄糖10mg，置于100 mL量瓶中，用純化水溶解并定容至100 mL，搖勻即得0.1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，備用。

5%苯酚溶液配制：取苯酚150 g，加鋅粉0.2 g和無水碳酸鈉0.1 g，蒸餾收集182℃餾分，稱取此餾分50.0 g置于1000 mL容量瓶中，加水溶解定容，搖勻后置于棕色瓶中，放入冰箱避光保存，備用。

1.3　靈芝孢子粉多糖檢測(cè)方法的優(yōu)化

1.3.1最大吸收波長的確定

分別吸取“1.2.2”中制備的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和“1.2.1”中制備的靈芝孢子粉多糖溶液各1.0mL，置于25 mL具塞試管中，分別加入5%苯酚溶液1.5 mL，搖勻后分別迅速加入濃硫酸7.0 mL，30℃水浴30 min，以相應(yīng)試劑空白為參比，采用紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，波長范圍400 nm～600 nm，確定其最大吸收波長。

1.3.2分光光度法測(cè)定靈芝孢子粉多糖含量

分別稱取“1.2.1”中制備的0.25 g靈芝孢子粉粗多糖提取物，按料液比1:40加入水，置于90℃水浴3 h，5000 r·min-1離心15min后取上清液，加5倍量無水乙醇，于4℃冰箱中靜置過夜，沉淀物加水溶解至100 mL，即得靈芝孢子粉多糖溶液。取1.0 mL靈芝孢子粉多糖溶液于25mL具塞試管中，加入5%苯酚溶液0.5mL和濃硫酸溶液2.5mL，搖勻，沸水浴反應(yīng)30 min，冷卻后測(cè)其吸光度值，平行測(cè)定3次，在“1.3.1”項(xiàng)確定的檢測(cè)波長處測(cè)定吸光度，多糖含量按文獻(xiàn)[13]方法計(jì)算。

1.3.3單因素試驗(yàn)

（1）苯酚和濃硫酸用量的確定

分別取2份“1.3.2”中制備的靈芝孢子粉多糖溶液1.0mL于25 mL具塞試管中，加入1.5 mL 5%苯酚溶液、7.0 mL濃硫酸溶液為體系A(chǔ)，加入0.5 mL 5%苯酚溶液、2.5 mL濃硫酸溶液為體系B，搖勻，沸水浴反應(yīng)30 min，冷卻后測(cè)其吸光度值，平行測(cè)定3次，確定檢測(cè)試劑苯酚和濃硫酸的使用量。

（2） 提取溫度

稱取3份靈芝孢子粉粗多糖提取物樣品0.25 g，按“1.3.2”項(xiàng)中的方法提取多糖，固定提取時(shí)間為3 h，提取料液比為1:40，加入5倍量無水乙醇，0.5 mL 5%苯酚溶液，2.5 mL濃硫酸溶液，搖勻，沸水浴反應(yīng)30 min，冷卻后測(cè)其吸光度值。設(shè)置提取溫度為80℃、90℃、100℃，考察不同提取溫度對(duì)多糖檢測(cè)的影響。

（3） 提取時(shí)間

稱取3份靈芝孢子粉粗多糖提取物樣品0.25 g，按“1.3.2”項(xiàng)中方法提取多糖，固定提取溫度為90℃，提取料液比為1:40，加入5倍量無水乙醇，其余操作同1.3.3（2） 項(xiàng)。設(shè)置提取時(shí)間為1 h、2 h、3 h，考察不同提取時(shí)間對(duì)多糖檢測(cè)的影響。

（4） 提取料液比

稱取3份靈芝孢子粉粗多糖提取物樣品0.25 g，按“1.3.2”項(xiàng)中方法提取多糖，固定提取溫度為90℃，提取時(shí)間為3 h，加入5倍量無水乙醇，其余操作同1.3.3（2） 項(xiàng)。設(shè)置不同料液比1:20、1:40、1:60，考察不同料液比對(duì)多糖檢測(cè)的影響。

（5） 乙醇濃度

稱取3份靈芝孢子粉粗多糖提取物樣品0.25 g，按“1.3.2”項(xiàng)中方法提取多糖，固定提取溫度為90℃，料液比為1:40，提取時(shí)間為3 h，無水乙醇，其余操作同1.3.3（2） 項(xiàng)。設(shè)置加入5倍量濃度為75%、85%和無水乙醇，考察不同乙醇濃度對(duì)多糖檢測(cè)的影響。

1.3.4正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，擬定對(duì)測(cè)定靈芝孢子粉多糖含量影響的3個(gè)因素，提取溫度（a）、提取時(shí)間（b）、提取料液比（c） 為優(yōu)選因素，進(jìn)一步考察以上因素對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響，優(yōu)化檢測(cè)方法。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1　Factors and levels of orthogonal test

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，加水至1 mL，加入 0.5 mL 5%苯酚和2.5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴反應(yīng)30 min，冷卻后，以空白試劑作為參比，在由1.3.1項(xiàng)確定的最大吸收波長處測(cè)定其吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量濃度（C） 為橫坐標(biāo)，吸光度（A） 為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6精密度試驗(yàn)

取適量“1.3.5”項(xiàng)中的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，加水至1 mL，按“1.3.5”項(xiàng)中方法測(cè)定吸光度，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，計(jì)算RSD值。

1.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“1.3.2”項(xiàng)中制備的靈芝孢子粉多糖溶液適量，按照“1.3.5”項(xiàng)下方法顯色，分別放置0、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 進(jìn)樣測(cè)定，記錄吸光度。

1.3.8重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取“1.3.2”項(xiàng)下同一批靈芝孢子粉多糖適量，共6份，按照“1.3.5”項(xiàng)下方法顯色，進(jìn)樣測(cè)定，記錄吸光度。

1.3.9加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取“1.2.1”中制備的已知靈芝孢子粉多糖含量的樣品6份，每份約0.1 g，精密稱取，分別加入葡萄糖儲(chǔ)備液適量，按照“1.3.5”項(xiàng)下方法顯色，測(cè)定吸光度，計(jì)算加標(biāo)回收率[14]。

1.3.10不同檢測(cè)方法對(duì)多糖含量的研究

目前尚未頒布關(guān)于多糖檢測(cè)方法的國家標(biāo)準(zhǔn)，食用菌企業(yè)制定多糖類產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)多采用食用菌農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》。因此，本文在確定靈芝孢子粉最優(yōu)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，與食用菌農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較研究，進(jìn)一步探討不同檢測(cè)方法對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響。

2　結(jié)果與討論

2.1　最大吸收波長的確定

葡萄糖和靈芝孢子粉多糖的最大吸收波長如圖1所示。

圖1　葡萄糖和靈芝孢子粉多糖的最大吸收波長Fig.1　Maximum absorption wavelength of glucose and Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

由圖1結(jié)果可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和靈芝孢子粉多糖溶液均在489 nm附近處有最大吸收度，說明以葡萄糖為標(biāo)品測(cè)定靈芝孢子粉多糖含量的方法可靠。故選取489 nm作為靈芝孢子粉多糖的檢測(cè)波長。

2.2　苯酚和濃硫酸用量的確定

不同苯酚與濃硫酸用量的影響如表2所示。

表2苯酚與濃硫酸用量對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響Tab.2 Effect of phenol and concentrated sulfuric acid on the contents of Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

表2結(jié)果表明，2個(gè)體系中苯酚與濃硫酸的添加量均能有效測(cè)定靈芝孢子粉多糖的含量，但體系B測(cè)得的靈芝孢子粉多糖含量高于體系A(chǔ)，說明苯酚和濃硫酸使用量越大時(shí)，靈芝孢子粉多糖含量呈下降趨勢(shì)，可能是由于加入過多的濃硫酸會(huì)使得多糖碳化嚴(yán)重[15]，同時(shí)大量使用濃硫酸存在安全隱患。因此，選擇體系B作為后續(xù)檢測(cè)的用量。

2.3　提取溫度對(duì)多糖含量的影響

提取溫度對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響見圖2。

圖2　提取溫度對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響Fig.2　Effectof extraction temperatures on the contents of Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

由圖2結(jié)果可知，提取溫度對(duì)靈芝孢子粉多糖檢測(cè)的影響較大，多糖含量隨溫度升高而增加，提取溫度為80℃時(shí)，靈芝孢子粉多糖含量較低，而溫度從90℃升至100℃時(shí)，多糖含量的增幅較小。因此，選擇90℃作為后續(xù)檢測(cè)試驗(yàn)的提取溫度。

2.4　提取時(shí)間對(duì)多糖含量的影響

提取時(shí)間對(duì)測(cè)定靈芝孢子粉多糖含量影響，見圖3。

由圖3結(jié)果可知，在提取溫度90℃、料液比1:40條件下，延長提取時(shí)間，有利于增加靈芝孢子粉提取物中多糖的溶出，提取時(shí)間3 h時(shí)，多糖含量比提取時(shí)間2 h增加明顯，因此，選擇3 h為測(cè)定靈芝孢子粉多糖含量的提取時(shí)間。

圖3　提取時(shí)間對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響Fig.3　Effectof extraction times on the contents of Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

2.5　提取料液比對(duì)多糖含量的影響

提取料液比對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響，見圖4。

圖4　提取料液比對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響Fig.4　Effectof extraction solid-liquid ratios on the contents of Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

由圖4結(jié)果可知，隨著提取料液比的增加，靈芝孢子粉多糖含量呈增加的趨勢(shì)，說明增加水溶劑，能使更多的靈芝孢子粉提取物中多糖溶解，而料液比1:60較1:40增加不明顯，即料液比為1:40時(shí)，靈芝孢子粉提取物中的多糖已基本提取完全。

2.6　乙醇濃度對(duì)多糖含量的影響

乙醇濃度對(duì)靈芝孢子粉多糖含量影響見圖5。

由圖5可知，隨著乙醇濃度的增加，獲得靈芝孢子粉多糖也隨之增加。采用無水乙醇進(jìn)行醇沉?xí)r，獲得靈芝孢子粉多糖較乙醇濃度為75%、85%時(shí)量多，因此，選擇無水乙醇作為多糖醇沉溶劑。

2.7　正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)及直觀分析和方差分析結(jié)果，見表3、表4。

由表3、表4可知，影響因素主次順序?yàn)樘崛r(shí)間＞提取溫度＞提取料液比。其中a因素中以k2最大，b因素中以k3最大，c因素中以k2最大，故選擇最佳檢測(cè)條件為b2a3c2，即提取溫度90℃，料液比注：F0.05（2，2） =19。Note:F0.05（2，2） =19.為1:40，提取時(shí)間3.0 h，采用無水乙醇沉淀靈芝孢子粉多糖。

圖5　乙醇濃度對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響Fig.5　Effectof ethanol concentrations on the contents of Ganoderma lucidum spore powder polysaccharides

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果及其直觀分析表Tab.3　The results of orthogonal testand intuitive analysis

表4　方差分析結(jié)果Tab.4　Variance analysis results

2.8　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6所示。由結(jié)果可知，葡萄糖濃度在 0.02mg·mL-1～0.1mg·mL-1的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。其回歸方程為y=14.595x-0.0009，R2=0.9993。

圖6　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　Standard curve of glucose

2.9　方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

2.9.1精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5　精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.5　Results of precision test

由表5結(jié)果可知，吸光度RSD值為0.74%，表明儀器精密度良好。

2.9.2穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表6。由表6可知，多糖含量的RSD值為0.38%，說明該方法在60min內(nèi)穩(wěn)定。

表6　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.6　Results of stability test

2.9.3重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.7　Results of repeatability test

由表7結(jié)果可知，多糖含量的RSD值為0.44%，表明優(yōu)化后的方法重現(xiàn)性良好。

2.9.4加標(biāo)回收試驗(yàn)

加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8　加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.8　Sample recovery test for the determination

由表8結(jié)果可知，加標(biāo)回收率為99.54%，RSD值為0.90%，表明優(yōu)化后的方法準(zhǔn)確性良好。

2.10　不同檢測(cè)方法對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響

不同檢測(cè)方法對(duì)多糖含量的影響見表9。

表9　不同檢測(cè)方法對(duì)靈芝孢子粉多糖含量的影響Tab.9　Effectof different detectionmethods on contentof Ganoderma lucidum spore powder polysaccharide

由表9結(jié)果可知，本文優(yōu)化后的檢測(cè)方法所測(cè)得的靈芝孢子粉多糖含量與農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》所規(guī)定的方法結(jié)果相差較小，說明減少檢測(cè)試劑苯酚濃硫酸的使用量，仍能有效檢測(cè)出靈芝孢子粉多糖，且不影響其含量測(cè)定結(jié)果。

3　結(jié)論

目前，國內(nèi)大多數(shù)食用菌企業(yè)采用農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》中苯酚-硫酸法檢測(cè)食用菌及其多糖含量，但苯酚-硫酸法在實(shí)際檢測(cè)過程中檢測(cè)試劑苯酚及濃硫酸的使用量過大，既不符合“綠色經(jīng)濟(jì)”的理念，也不利于檢測(cè)操作安全。因此，本文采用單因素試驗(yàn)考察了苯酚濃硫酸用量、提取溫度、提取時(shí)間、提取料液比以及乙醇濃度對(duì)測(cè)定靈芝孢子粉多糖含量的影響，并且在此基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化了反應(yīng)條件，進(jìn)一步分析優(yōu)化后的檢測(cè)方法，與農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1676-2008對(duì)測(cè)定靈芝孢子粉多糖含量的影響一致。

靈芝孢子粉多糖的最佳測(cè)定條件為：5%苯酚0.5 mL、濃硫酸2.5 mL，提取溫度90℃，提取3 h，料液比為1:40。結(jié)果表明，經(jīng)過優(yōu)化后的苯酚-硫酸法測(cè)定靈芝孢子粉多糖準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，與農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測(cè)定》所規(guī)定的方法結(jié)果相差較小。然而后者方法中所使用苯酚與濃硫酸的量為前者的一倍，可見優(yōu)化后的檢測(cè)方法不僅能降低有危害性試劑（苯酚、濃硫酸）的使用量，同時(shí)也能夠準(zhǔn)確測(cè)定靈芝孢子粉中多糖含量，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

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