盧穎穎，桂 陽，陳婭婭，曾令祥，朱國勝**

（1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州省農(nóng)作物品種資源研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院貴州省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州 貴陽 550006）

紅托竹蓀（Dictyophora rubrovolvataM.Zang,et al.）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）腹菌綱（Gasteromycetes） 鬼筆目 （Phallales） 鬼筆科 （Phallaceae） 竹蓀屬（Dictyophora）。紅托竹蓀是竹蓀中的珍品，藥食兩用真菌，具有很好的開發(fā)前景[1]。紅托竹蓀在貴州的人工種植面積日益增加，近年來紅托竹蓀腐爛病病害普遍發(fā)生，對紅托竹蓀產(chǎn)量造成嚴(yán)重的影響。筆者通過對貴州紅托竹蓀的幾個主栽地區(qū)發(fā)生病害的種植大棚調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其典型癥狀是初期形成水漬狀斑點(diǎn)，后期整個菌蛋腐爛不能正常出菇或形成畸形菇，一旦發(fā)病，整個大棚都會發(fā)病，減產(chǎn)甚至絕收，給紅托竹蓀生產(chǎn)造成很大的損失。

目前已報道的食用菌腐爛病多數(shù)是細(xì)菌性病害或真菌性病害，如糙皮側(cè)耳褐腐病，據(jù)其不同發(fā)病類型其病原菌有菌蓋疣孢霉（Mycogone perniciosaMagn.）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosaMigula）、樹枝狀輪指孢霉 （Dactylium dendroides）和半裸鏈孢霉（Fusarium semitectum）；金針菇黑腐病其病原菌為托拉氏假單胞菌（Pseudomonas tolaasii）；刺芹側(cè)耳軟腐病其病原菌為歐文氏菌屬（Erwiniasp.）[4-6]。針對紅托竹蓀腐爛病國內(nèi)許多專家進(jìn)行了許多有價值的研究和探討[1-3]，主要集中在研究引起該病的病原菌、蟲害、病害等方面，但尚未明確引起該病的具體原因。為明確紅托竹蓀腐爛病發(fā)病原因，筆者在貴州省織金縣和黔西南州安龍縣的紅托竹蓀生產(chǎn)基地，對紅托竹蓀腐爛病的發(fā)病程度和發(fā)病規(guī)律進(jìn)行調(diào)查，同時采集病害樣本，對該病害進(jìn)行發(fā)病原因的初步分析，研究結(jié)果如下。

1　材料與方法

1.1　病害情況調(diào)查

貴州省織金縣和黔西南州安龍縣皆為我國紅托竹蓀主產(chǎn)區(qū)，也是紅托竹蓀的傳統(tǒng)種植區(qū)。菌蛋期指竹蓀生長初期未成熟的時期。

病癥：病害一般從菌蛋開始感染，初期菌蛋表面出現(xiàn)黃色至淡紅色的水珠；中期菌蛋基部便出現(xiàn)針眼狀的孔，繼而開始腐爛；后期出現(xiàn)感染其他雜菌的現(xiàn)象，如綠霉等。如果尖頂期菌蛋發(fā)病，仍可出菇開傘，畸形或部分腐爛。

1.2　樣本采集

從貴州省農(nóng)作物品種資源研究所實驗菇房、黔西南布依族苗族自治州安龍縣龍廣鎮(zhèn)小場壩村農(nóng)望種植農(nóng)民專業(yè)合作社紅托竹蓀種植大棚、織金縣紅托竹蓀種植大棚分別采集了3組帶有水漬斑點(diǎn)的子實體樣本，至實驗室進(jìn)行病原菌研究。

1.3　疑似病原物的分離和觀察

1.3.1疑似病原物分離培養(yǎng)

（1）病斑處細(xì)菌的分離

在采集的3組樣品中每組取3個患病子實體，在病斑處進(jìn)行細(xì)菌分離。用75%的酒精棉球，擦拭菌蛋表面進(jìn)行消毒，把菌蛋沿病斑邊緣掰開，將表皮組織用滅菌的鑷子和解剖刀移除，然后分別鉤取約6 mm2的病變膠質(zhì)組織和內(nèi)部組織（尚未分離開的菌柄和菌蓋組織），置于裝有500μL滅菌水的EP管（離心管）中，用滅菌的玻璃棒將組織研碎混勻，放置10 min，使用滅菌的接種環(huán)蘸取混合液在牛肉蛋白胨培養(yǎng)基上劃線接種，25℃恒溫培養(yǎng)。

（2） 病斑處真菌的分離

在采集的3組樣品中每組取3個患病子實體，在病斑處進(jìn)行細(xì)菌分離。用滅過菌的接種鉤，挑取菌蛋病斑處的附生真菌菌絲，置于PDA平板培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)，觀察菌落的生長情況。

1.3.2顯微鏡觀察

在采集的3組樣品中每組取3個患病子實體，分別取病變組織和未病變組織進(jìn)行顯微觀察；在顯微鏡100×物鏡視野下觀察組織形態(tài)特征；將組織切片放在載玻片上加1滴水，蓋蓋玻片輕按，在顯微鏡40×物鏡下檢查是否有細(xì)菌渾濁液；將組織切片移走，渾濁液通過酒精燈火焰固定，革蘭氏染色法觀察。

1.4　分子鑒定

挑取純化后的細(xì)菌菌體，離心后置于離心管中，加入裂解液，震蕩后置于65℃中溫浴裂解，提取DNA，使用通用引物SR/SF擴(kuò)增16S rDNA片段。PCR反應(yīng)體系為30μL，其中10×PCR緩沖液3μL，dNTP（10mM） 3μL，正向和反向引物（100mmol·L-1）各1.5μL，TapDNA聚合酶1.2μL，模板DNA 3μL。PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性300 s；94℃變性30 s，52℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，33 個循環(huán)；72℃延伸600 s。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。利用16S rDNA的通用擴(kuò)增引物[7]（SF：5’-A GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SR：5’-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3’） 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將測得的序列進(jìn)行編輯，去掉序列兩端的引物，拼接后獲得16S rDNA序列。利用ClustalX軟件對獲得的16S rDNA序列進(jìn)行比對，序列相似比在99%以上的菌株分為一組。取每組的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，同源性較高（至少相似比在90%以上）的菌株作為參照對象，利用軟件Mega7鄰接法（Neighbor Joining） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5　疑似病原物致病性檢測

以紅托竹蓀常規(guī)栽培種作為樣本，選取疑似病原物的優(yōu)勢菌株進(jìn)行致病性檢測。用接種針挑取少許純化的優(yōu)勢菌株，直接穿刺在直徑4 cm～5 cm健康菌蛋表面接種，每個優(yōu)勢菌株接種5個竹蓀蛋。培育溫度在28℃～30℃，環(huán)境濕度保持在90%以下，常規(guī)管理，觀察發(fā)病情況。

2　結(jié)果與分析

2.1　發(fā)病情況

通過研究發(fā)現(xiàn)，在安龍縣和織金縣調(diào)查的3個菇棚中，腐爛病病害的發(fā)病率達(dá)到60%～80%。該病害主要發(fā)生在7月～9月，發(fā)病期菇棚內(nèi)的溫度在32℃～35℃。病斑產(chǎn)生在菌蛋表面，起初為淡黃色水珠，水珠消失留下水印，后期各種雜菌感染逐漸腐爛。

2.2　發(fā)病特征

紅托竹蓀栽培過程中，腐爛病多發(fā)生在菌蛋期，發(fā)病初期，其癥狀為菌蛋菌皮表面有淡紅色水漬狀斑點(diǎn)，可看到斑點(diǎn)上凝結(jié)小水珠，中期水珠消失，水漬狀斑點(diǎn)變大至直徑為0.5 cm～2 cm，斑點(diǎn)顏色變?yōu)榘导t色，后期斑點(diǎn)處可看到感染各種雜菌，出現(xiàn)白色或綠色菌斑。球形期的菌蛋發(fā)病，最終整個菌蛋腐爛而不能正常出菇，尖頂期發(fā)病的菌蛋仍可出菇，但菇體部分腐爛或為畸形菇。如圖1所示。

圖1　紅托竹蓀腐爛病癥狀Fig.1　Typical symptoms of the Dictyophora rubrovolvata rot disease

2.3　顯微鏡觀察結(jié)果

顯微鏡觀察病斑組織成絮狀，且菌皮下的發(fā)病膠質(zhì)層組織有解體腐爛的現(xiàn)象。病斑組織切片，在顯微鏡低倍視野下，可以看到有渾濁的細(xì)菌液，革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，存在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌菌體。

2.4　病變組織塊分離結(jié)果

分離培養(yǎng)的病變組織為菌蛋的膠狀層，從外觀看病變膠質(zhì)層組織已經(jīng)出現(xiàn)組織解體現(xiàn)象，用接種鉤在無菌操作下鉤取病變膠質(zhì)層組織至PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，24 h后發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌菌落生長，2 d后仍未發(fā)現(xiàn)病變組織萌發(fā)。用接種環(huán)蘸取少量細(xì)菌菌體至LB培養(yǎng)基上，劃線涂布培養(yǎng)獲得單菌落，菌落形態(tài)與吸取的病斑上水珠培養(yǎng)的細(xì)菌菌落形態(tài)及病變菌皮培養(yǎng)獲得細(xì)菌菌落形態(tài)一致。

2.5　附生菌株初步鑒定

在所采集的3組樣品中，通過培養(yǎng)觀察挑取了13個優(yōu)勢菌株，利用引物SR/SF擴(kuò)增16S rDNA片段大約為0.7 kb～1.5 kb。利用軟件MEGA中Align方法對測序序列進(jìn)行比對分析，采用MEGA軟件對比對結(jié)果進(jìn)行聚類分析見圖2。

圖2　序列比對結(jié)果Fig.2　Sequence comparison results

根據(jù)聚類結(jié)果分別挑選序列1-S、J1、T12、2-B、B11、J21、B12、J11在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對，根據(jù)比對結(jié)果選擇相似值達(dá)到99%以上的模式菌株序列，模式菌株序列號分別為：KT291174、KY681833、KX822678、 KY780237、 LN564012、GQ306158、KY753321和KX131107。利用軟件MegAlign中ClustalW方法對所獲得序列進(jìn)行比對、聚類分析，利用軟件Mega7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。

從圖3可看出，所分離的疑似病原菌菌株主要與芽孢桿菌屬 （Bacillussp.，KT291174、KY753321）細(xì)菌、腸桿菌屬（Enterobactersp.，KY681833） 細(xì)菌和伯克霍爾德菌屬（Burkholderiasp.，GQ306158）細(xì)菌相類似，可基本確定所分離出的優(yōu)勢細(xì)菌主要屬于這三類細(xì)菌。這三個屬的細(xì)菌為自然界土壤、空氣、水等環(huán)境中普遍存在的細(xì)菌。

圖3　分離菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中模式菌株比對結(jié)果Fig.3　Comparison results of isolated strainswithmodel strains in NCBIdatabase

通過對所分離出的13個細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)上述三類細(xì)菌的3個代表菌株B11、J2、B1分別屬于革蘭氏陰性菌（腸桿菌屬Enterobactersp.）、革蘭氏陽性菌（芽孢桿菌屬Bacillussp.）和革蘭氏陰性菌（伯克霍爾德菌屬Burkholderiasp.）。

2.6　致病性檢測結(jié)果

疑似病原物致病性檢測，通過回接試驗共接種了B1、J2等13個疑似病原菌，觀察均未發(fā)現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)。

3　討論

紅托竹蓀腐爛病主要對子實體的外觀和產(chǎn)量造成嚴(yán)重影響，導(dǎo)致紅托竹蓀收益損失嚴(yán)重。本課題研究主要從安龍縣、織金縣的種植大棚以及貴陽的出菇大棚采集患病菌蛋樣本，通過顯微觀察和分離培養(yǎng)水漬狀病變組織內(nèi)的細(xì)菌，分離到的優(yōu)勢菌在回接試驗中均未表現(xiàn)出致病性。

紅托竹蓀大棚栽培一般是在7月～9月份出菇，該病害主要發(fā)生在出菇期，且為大棚出菇病害，林下或仿野生種植并不發(fā)生此病害，大棚種植在夏季易形成高溫、高濕環(huán)境，初步推斷紅托竹蓀腐爛病癥狀的發(fā)生與出菇時溫度、濕度有關(guān)，還需進(jìn)一步研究驗證。

杏鮑菇細(xì)菌性病害，在病斑處產(chǎn)生膿液。平菇和雙孢蘑菇細(xì)菌性褐斑病等細(xì)菌性病害，在潮濕情況下，子實體的病斑處均有細(xì)菌膿液產(chǎn)生，且伴有難聞氣味。在紅托竹蓀腐爛病菌蛋表面的水漬狀斑點(diǎn)形成和發(fā)展過程中，斑點(diǎn)表面未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)菌性膿液。且取水漬狀斑點(diǎn)表皮組織進(jìn)行培養(yǎng)，在PDA培養(yǎng)基上可以正常萌發(fā)，其菌絲形態(tài)與正常子實體組織的菌絲形態(tài)無明顯差異，說明水漬狀病變組織未發(fā)生壞死。

真菌菌絲細(xì)胞壁表面的疏水蛋白（hydrophobin）可利用其疏水作用來維持子實體內(nèi)的空氣通道（air channels） 和菌絲間空隙[9-13]。文獻(xiàn)報道裂褶菌（Schizophyllum commune） 的疏水蛋白基因sc4被敲除后，可引起裂褶菌子實體的空氣通道充水而呈水漬狀[11]；脈孢菌（Neurospora crassa）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans） 和稻瘟病菌 （Magnaporthe grisea） 的疏水蛋白基因 Eas[15]、rodA[14]和 Mpg[13]被敲除后，均導(dǎo)致分生孢子囊或氣生菌絲呈現(xiàn)水漬狀[8-15]。紅托竹蓀腐爛病的水漬狀斑點(diǎn)的表征與敲除掉疏水蛋白基因的癥狀類似，該病的發(fā)生可能與疏水蛋白基因的調(diào)控表達(dá)有關(guān)。需進(jìn)一步深入研究紅托竹蓀腐爛病水漬狀斑點(diǎn)的形成與紅托竹蓀子實體疏水蛋白基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律的關(guān)系。

本研究尚未對該病害進(jìn)行原生生物和病毒等相關(guān)研究，暫不能確定紅托竹蓀腐爛病與原生生物和病毒的關(guān)系。

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