尹明華　鄧紅根　蔣　妍　萬(wàn)　琳　吳麗霞　凌　飛　汪金華

(上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，上饒　334001)

薯蕷屬(DioscoreaL.)為單子葉植物綱、薯蕷科(Dioscoreaceae)中最大的一個(gè)屬。我國(guó)薯蕷屬植物分為6個(gè)組，即根狀莖組、丁字形毛組、頂生翅組、基生翅組、復(fù)葉組、周生翅組。黃獨(dú)(D.bulbiferaL.)屬于基生翅組，其地下塊莖黃藥子，含有diosbulbin A-H 8種黃獨(dú)素，還含有黃酮類、蒽醌類、鞣質(zhì)及糖類、淀粉等，具有涼血，降火，消癭，解毒等功效，主治甲狀腺腫大、咽喉腫痛、咯血、百日咳等病，也可用于多種癌癥的治療[1]。由于黃獨(dú)野生種質(zhì)資源的過(guò)度開采和使用，其產(chǎn)量已逐年萎縮，且多采用營(yíng)養(yǎng)繁殖的方法進(jìn)行栽培，病毒感染嚴(yán)重，品質(zhì)也在不斷退化。因此，對(duì)黃獨(dú)種質(zhì)資源實(shí)施有效保存已迫在眉睫。離體保存技術(shù)克服了傳統(tǒng)種植保存占用土地、易受病蟲害和自然災(zāi)害的影響、管理費(fèi)用高等缺點(diǎn)，具有占用空間小、可排除病蟲和病毒等的侵染、生產(chǎn)上需要即可快速地大量繁殖、費(fèi)用低廉等優(yōu)點(diǎn)，目前受到廣泛的關(guān)注和重視[2]。離體保存主要有超低溫和低溫二種方式。超低溫保存是將材料貯存在液氮中，是一種比較穩(wěn)妥的長(zhǎng)期保存種質(zhì)的方法；而低溫保存則是通過(guò)降低溫度，抑制植物材料的生長(zhǎng)，從而延長(zhǎng)其繼代時(shí)間，與超低溫保存比起來(lái)，具有簡(jiǎn)單方便、操作容易，適合用于植物種質(zhì)資源的中短期保存[3]。

微型塊莖又稱零余子，是薯蕷屬植物腋芽形成的變態(tài)塊莖，也俗稱“珠芽”，具有體積小，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，常作為大田種植的繁殖材料，尤其是利用脫毒苗獲得的脫毒微型塊莖更是優(yōu)質(zhì)種苗的重要來(lái)源[4]。目前，對(duì)薯蕷屬植物微型塊莖的誘導(dǎo)[5～11]、休眠和萌發(fā)[12]多有報(bào)道，但關(guān)于薯蕷屬微型塊莖的低溫保存研究極少，在國(guó)內(nèi)，韋本輝等[13]對(duì)淮山微型塊莖的低溫保存進(jìn)行了研究；在國(guó)外，Ovono等[14]對(duì)山藥(Dioscoreacayenensis-D.rotundatacomplex)的微型塊莖進(jìn)行了低溫(18℃)保存，指出其微型塊莖在18℃下低溫保存2～4周后需要24周以上的時(shí)間才能萌發(fā)。我們對(duì)黃獨(dú)微型塊莖的低溫保存進(jìn)行了前期研究，對(duì)其低溫保存期間的解剖結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)[15]，但植物低溫脅迫下會(huì)產(chǎn)生自身免疫應(yīng)答反應(yīng)，代謝物在這種免疫反應(yīng)中扮演著非常重要的角色。代謝產(chǎn)物的水平可以被看作生物系統(tǒng)對(duì)遺傳或環(huán)境變化的最終響應(yīng)，有利于更直觀有效地了解生物學(xué)過(guò)程及其機(jī)理[16]。代謝組學(xué)是研究生物體或者組織甚至單個(gè)細(xì)胞的全部小分子代謝物成分及其隨時(shí)間變化而變化的學(xué)科[17]。在眾多代謝組學(xué)分析技術(shù)中，氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)較為成熟，分辨率高、靈敏度高、重現(xiàn)性好，擁有大量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)且成本相對(duì)低廉，很早就應(yīng)用到植物代謝組學(xué)研究領(lǐng)域，迄今仍然是主要分析平臺(tái)之一[18]。目前，低溫對(duì)模式植物擬南芥代謝的影響研究較深入。Cook等[19]使用GC-TOF/MS大規(guī)模研究擬南芥冷害的代謝應(yīng)答途徑，結(jié)果表明冷馴化與代謝組密切相關(guān)。在黃獨(dú)微型塊莖的低溫保存過(guò)程中，其代謝產(chǎn)物的水平有何變化尚未見相關(guān)報(bào)道。本文以黃獨(dú)微型塊莖為研究對(duì)象，基于GC-MS的代謝組學(xué)方法，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)與生物信息學(xué)分析手段，對(duì)其低溫保存的代謝組學(xué)進(jìn)行分析，旨在為黃獨(dú)微型塊莖的低溫離體保存以及其后續(xù)萌發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　材料和儀器

黃獨(dú)微型塊莖(上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供)。

1.2　方法

1.2.1微型塊莖的誘導(dǎo)及其低溫離體保存

利用黃獨(dú)試管苗的帶芽莖段，接種到MS+KT 2 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖60 g·L-1的液體培養(yǎng)基中，使其誘導(dǎo)出微型塊莖，然后挑選出直徑約0.5 cm的微型塊莖轉(zhuǎn)移到無(wú)菌100 mL三角瓶(空瓶)中，然后進(jìn)行4℃低溫離體保存。試驗(yàn)材料分成4℃處理組(以Con4表示)和25℃對(duì)照組(以Con25表示)，保存60 d后進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)檢測(cè)。

1.2.2低溫離體保存微型塊莖的代謝組學(xué)檢測(cè)

把以上兩組試驗(yàn)樣品100 mg在液氮中磨碎，并轉(zhuǎn)移到10 mL離心管，加入1 400 μL 100%的甲醇(預(yù)冷至-20℃)，然后渦旋振蕩30 s，60 μL的核糖醇(0.2 mg·mL-1)作為內(nèi)標(biāo)，渦旋振蕩30 s，放入超聲波清洗機(jī)處理15 min，加入750 μL氯仿與1 400 μL水震蕩混合混勻，4 000 r·min-1離心15 min,上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管，樣品用氮?dú)獯蹈?加入60 μL甲氧基吡啶溶液(15 mg·mL-1)渦旋振蕩30 s，過(guò)夜反應(yīng)16 h。最后，加入60 μL BSTFA試劑(含1%三甲基氯硅烷)，常溫條件下反應(yīng)60 min。經(jīng)過(guò)以上的反應(yīng)，為次生代謝物含量的樣品進(jìn)行了測(cè)定，使用檢測(cè)設(shè)備為Agilent 7890A/5975C 氣—質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫，美國(guó))。GC/MS檢測(cè)程序：色譜條件：色譜柱HP-5MS毛細(xì)管柱(5% phenyl methyl silox：30 m×250 μm i.d.，0.25 μm；agilent J&W scientific，F(xiàn)olsom，CA)；分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL，分流比20∶1。進(jìn)樣口溫度280℃；離子源溫度250℃；接口溫度150℃。程序升溫起始溫度40℃；保持5 min，以10℃·min-1升至300℃，保持5 min。載氣為氦氣，流速1 mL·min-1。MS條件：電噴霧電離(ESI)源，全掃描方式，電子能量70eV；四極桿掃描范圍m/z 35-780。

1.2.3數(shù)據(jù)處理和分析

利用GC-MS預(yù)處理軟件XCMS(www.bioconductor.org/)對(duì)Agilent 7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)獲得的原始文件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理。首先從Agilent MSD ChemStation工作站獲得的原始的GC/MS數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成CDF格式(Net CDF)。然后利用XCMS程序進(jìn)行峰識(shí)別、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊等工作，逐一考察及優(yōu)化了各個(gè)參數(shù)，并通過(guò)手動(dòng)提取任意質(zhì)量色譜峰來(lái)驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，最終確定了XCMS的各個(gè)參數(shù)。除了XCMS默認(rèn)的參數(shù)以外進(jìn)行了如下的調(diào)整：xcmsSet(fwhm=3，snthresh=3，mzdiff=0.5，step=0.1，steps=2，ma=300)，retcor(method=“obiwarp”，plottype=c(“deviation”))，bandwidth(bw)為2，minfrac=0.3。為了分析多元線性回歸，XCMS的最終結(jié)果導(dǎo)出至EXCLE進(jìn)行進(jìn)一步的分析。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，方法是內(nèi)標(biāo)法(ribitol))。對(duì)樣本進(jìn)行信息比對(duì)分析，并對(duì)得到數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析包括：數(shù)據(jù)預(yù)處理，化合物鑒定，主成分分析(PCA分析)，偏最小二乘法—判別分析(PLS-DA分析)，差異化合物篩選。

2　結(jié)果與分析

2.1　代謝物注釋

對(duì)上述獲得的保留時(shí)間、質(zhì)核比及峰強(qiáng)的矩陣(共213個(gè)變量)進(jìn)行代謝物的注釋，注釋所用數(shù)據(jù)庫(kù)為NIST商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)(NIST 2008)和wiley 9代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)。最終獲得90個(gè)可以被數(shù)據(jù)庫(kù)注釋的變量。大量的物質(zhì)由于信號(hào)低或者沒(méi)有數(shù)據(jù)庫(kù)收錄而沒(méi)有被注釋到。

2.2　所有樣本主成分分析(PCA)

首先對(duì)所有樣本進(jìn)行主成分分析。在Simca-P 11.0軟件中，數(shù)據(jù)采用Par變換，首先進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，觀察各族數(shù)據(jù)的聚類并去除離群樣本。結(jié)果表明，R2X為0.598，Q2為-0.004 5，由此可以推斷模型質(zhì)量較好，擬合處理能夠有效的找出樣品分類的最大差異，適合做后續(xù)分析。兩組PCA得分圖(Scores plot)如圖1所示，樣本基本都處于95%置信區(qū)間(Hotelling T2 ellipse)內(nèi)。

圖1　處理組和對(duì)照組PCA得分圖Fig.1　PCA score chart of treatment group and control group

2.3　所有樣本偏最小二乘方—判別分析(PLS-DA)

用偏最小二乘判別分析(Partial Least Squares-Discriminant Analysis,PLS-DA)進(jìn)行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，并采用置換檢驗(yàn)(permutation test)防止PLS-DA模型的過(guò)度擬合。并進(jìn)一步通過(guò)PLS-DA模型變量的VIP值(Variable Importance on Projection)對(duì)差異變量進(jìn)行篩選。本節(jié)采用PLS-DA這種監(jiān)督的多維統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)這樣本進(jìn)行模型分析。并進(jìn)一步對(duì)模型的質(zhì)量用交叉驗(yàn)證法進(jìn)行檢驗(yàn)，并用交叉驗(yàn)證后得到的R2X和Q2(分別代表模型可解釋的變量及模型的可預(yù)測(cè)度)對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判。結(jié)果表明，R2X為0.451，R2Y為0.954，Q2為0.688。得分圖如圖2所示(橫坐標(biāo)為第1主成分得分，用t表示；縱坐標(biāo)為第2主成分得分，用t表示)。R2Y(即監(jiān)督模型的解釋率)說(shuō)明PLS-DA模型已經(jīng)可以很好地解釋各組樣本之間的差異。在此之后，對(duì)于PLS-DA模型進(jìn)行置換檢驗(yàn)(permutation test)，100次驗(yàn)證結(jié)果顯示R2在Y軸上的截距為0.654，Q2在Y軸上的截距為-0.319(圖3)。從各組的模型預(yù)測(cè)參數(shù)的R2X、R2Y、Q2Y來(lái)看，上述的模型是有效和可靠的，因其符合以下標(biāo)準(zhǔn)[20]：Q2Y>0.5被認(rèn)為是有效的模型，Q2Y>0.9被認(rèn)為是出色的模型，0

在載荷圖中(Loading plot)中(圖4)，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的點(diǎn)表示對(duì)各組分類的貢獻(xiàn)越大。

圖2　處理組和對(duì)照組的PLS-DA得分圖Fig.2　PLS-DA score chart of treatment group and control group

圖3　處理組和對(duì)照組的PLS-DA置換檢驗(yàn)圖Fig.3　PLS-DA permutation test chart of treatment group and control group

圖4　處理組和對(duì)照組的PLS-DA載荷圖Fig.4　PLS-DA loading plot of treatment group and control group

2.4　所有樣本熱圖分析

對(duì)獲得的代謝物進(jìn)行樣本和代謝物的雙向聚類，所用方法為：層次聚類。從圖5可以看出哪些樣本具有相似的代謝譜，哪些代謝物具有相似的代謝方式，并聚集在一起，聚類軟件為R語(yǔ)言(www.r-project.org)包Pheatmap。

2.5　代謝物關(guān)聯(lián)性分析

對(duì)所有的代謝物進(jìn)行時(shí)間序列的關(guān)聯(lián)性分析，采用方法為皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficients)分析，關(guān)聯(lián)性矩陣用R語(yǔ)言的pheatmap包進(jìn)行熱圖的繪制(圖6)。代謝物之間的相關(guān)系數(shù)的計(jì)算同時(shí)綜合了所有時(shí)間點(diǎn)。其中1為表示完全正相關(guān)，-1為表示完全負(fù)相關(guān)。

圖5　處理組和對(duì)照組代謝物熱圖分析Fig.5　Thermal analysis of treatment group and control group

2.6　差異顯著的代謝物

采用學(xué)生氏T檢驗(yàn)來(lái)尋找差異代謝物，閾值為P<0.05，并結(jié)合倍第一主成分的VIP值(Variable Importance in the Projection)來(lái)判斷差異的代謝物(FC>=1.5或者FC<0.75)，差異結(jié)果見表1。處理組和對(duì)照組的差異性代謝物有丙氨酸(Alanine)、兒茶素(Catechin)、檸檬酸(Citric acid)、N,N-雙(2-羥乙基)甲胺(N,N-Di-(2-Hydroxyethyl)-methanamine)、水楊酸(Salicylic acid)和山梨糖(Sorbose)。

圖6　處理組和對(duì)照組代謝物×代謝物相關(guān)性分析Fig.6　Correlation analysis of metabolites×metabolites of treatment group and control group

Table2KEGGcommentsofdifferentialmetabolites

查詢Query匹配Match人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)PubChem京都基因與基因組百科全書KEGG注釋CommentAlanineAlanineMETPA0179NAC014011CatechinCatechinHMDB027809064C065621N,N-Di-(2-Hydroxyethyl)-methanamineNANANANA0SalicylicacidSalicylicacidHMDB01895338C008051SorboseL-SorboseHMDB01266441484C083561

注：1.確切注釋；2.有疑問(wèn)；0.無(wú)注釋

Note:1. The exact notes; 2. A question; 0. No comment

2.7　差異代謝物的KEGG注釋

對(duì)差異代謝物進(jìn)行KEGG compound名稱注釋。獲得KEGG compound ID(表2)。并進(jìn)行KEGG pathway注釋工作。獲得KEGG pathway(表3)。在黃獨(dú)微型塊莖4℃離體保存中，丙氨酸(Alanine)參與氰基氨基酸代謝；兒茶素(Catechin)參與次生代謝產(chǎn)物生物合成、黃酮類化合物的生物合成和苯丙素的生物合成；水楊酸(Salicylic acid)參與多環(huán)芳烴降解、微生物在不同環(huán)境中的代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、二惡英降解、苯丙氨酸代謝、芳烴降解、植物激素生物合成、鐵載體組非核糖體肽合成和苯丙素的生物合成等。檸檬酸(Citric acid)參與來(lái)自鳥氨酸、賴氨酸和煙酸的生物堿生物合成、組氨酸和嘌呤的生物堿生物合成、微生物在不同環(huán)境中的代謝、植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、2-氧代羧酸代謝、萜類和類固醇的生物合成、原核生物固碳途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、 來(lái)自莽草酸途徑的生物堿生物合成、來(lái)自萜類化合物和聚酮的生物堿生物合成、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、植物激素生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、雙組分系統(tǒng)、苯丙素的生物合成以及來(lái)自鳥氨酸，賴氨酸和煙酸的生物堿生物合成等。

表3　差異代謝物的KEGG pathway注釋

3　討論

代謝組學(xué)為較為全面地研究植物復(fù)雜代謝過(guò)程及其產(chǎn)物，從而為分析植物次生代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、限速步驟，解析細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程，是研究植物體內(nèi)復(fù)雜生理代謝物的波動(dòng)是一種非常有效的方法[21]。本研究通過(guò)對(duì)黃獨(dú)低溫離體保存的微型塊莖進(jìn)行GC/MS代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明，與黃獨(dú)微型塊莖25℃離體保存相比較，黃獨(dú)微型塊莖4℃離體保存的差異性代謝物有丙氨酸(Alanine)、兒茶素(Catechin)、N,N-雙(2-羥乙基)甲胺(N,N-Di-(2-Hydroxyethyl)-methanamine)、水楊酸(Salicylic acid)和山梨糖(Sorbose)。

其中，丙氨酸(Alanine)在黃獨(dú)微型塊莖低溫離體保存中主要參與氰基氨基酸代謝；兒茶素(Catechin)是主要的類黃酮化合物之一，具有抗氧化、抗誘變、抗癌、抗心血管疾病、紫外線輻射的保護(hù)作用以及抗糖尿病、抗菌消炎、減肥和帕金森病的治療等作用[22]。在黃獨(dú)微型塊莖低溫離體保存中主要參與次生代謝產(chǎn)物生物合成、黃酮類化合物的生物合成和苯丙素的生物合成。

水楊酸(Salicylic acid)是植物體內(nèi)普遍存在的一種酚類化合物，可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性[23]。水楊酸可以提高植物抵抗高溫、低溫、鹽害、重金屬及干旱等逆境的能力，還可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性[24]。在黃獨(dú)微型塊莖低溫離體保存中主要參與多環(huán)芳烴降解、微生物在不同環(huán)境中的代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝產(chǎn)物生物合成、二惡英降解、苯丙氨酸代謝、芳烴降解、植物激素生物合成、鐵載體組非核糖體肽合成和苯丙素的生物合成等。

檸檬酸(Citric acid)代謝涉及到檸檬酸合成與降解二個(gè)方面，其合成途徑以三羧酸(TCA)循環(huán)為主，其降解有γ-氨基丁酸(GABA)途徑和谷氨酰胺合成酶(GS)途徑。檸檬酸代謝涉及到許多不同的酶，主要有檸檬酸合成酶、順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸脫羧酶等[25]。同時(shí)，檸檬酸作為植物體內(nèi)廣泛存在的一類生物小分子，可以為植物細(xì)胞提供質(zhì)子，從而啟動(dòng)很多代謝反應(yīng)，與植物逆境生理密切相關(guān)，是植物體內(nèi)關(guān)鍵的代謝物，參與C4循環(huán)等眾多代謝途徑，可以顯著提高植物體的耐酸性和對(duì)逆境的抗性[26]。在黃獨(dú)微型塊莖低溫離體保存中主要參與來(lái)自鳥氨酸、賴氨酸和煙酸的生物堿生物合成、組氨酸和嘌呤的生物堿生物合成、微生物在不同環(huán)境中的代謝、植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成、2-氧代羧酸代謝、萜類和類固醇的生物合成、原核生物固碳途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、來(lái)自莽草酸途徑的生物堿生物合成、來(lái)自萜類化合物和聚酮的生物堿生物合成、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、植物激素生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、雙組分系統(tǒng)、苯丙素的生物合成以及來(lái)自鳥氨酸，賴氨酸和煙酸的生物堿生物合成等。

黃獨(dú)低溫離體保存微型塊莖差異代謝物的初步發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步了解黃獨(dú)微型塊莖低溫離體保存的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為低溫離體保存黃獨(dú)微型塊莖的破除休眠以及其后續(xù)萌發(fā)提供了理論依據(jù)。

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