熊海燕　劉志雄

(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，荊州　434025)

深山含笑(MicheliamaudiaeDunn)是木蘭科(Magnoliaceae)含笑屬(Michelia)常綠喬木，因其樹姿優(yōu)美、花色潔白、花型娟秀雅致、花大芬芳、花期長，觀賞價值高且花香宜人，少數(shù)種質(zhì)具有春秋兩季開花等優(yōu)點，在長江流域及以南地區(qū)被廣泛用于園林綠化和景觀建設(shè)。深山含笑是我國特有的珍貴樹種，主產(chǎn)于浙江、福建、湖南、廣東、廣西、貴州等地[1]。目前用于庭園景觀營造和四旁綠化的深山含笑多為直接引種馴化的種子實生苗后代或嫁接植株，花色單調(diào)，加之耐寒性差的特點極大限制了這一珍貴觀賞樹種在長江、淮南以北地區(qū)的推廣應(yīng)用。挖掘優(yōu)良、珍稀和特異深山含笑新種質(zhì)、開展其花型、花色、花香、株型和抗逆性形成的機制與遺傳規(guī)律研究，選育觀賞價值高、抗寒性強及適應(yīng)性廣的深山含笑新品種，對加快其開發(fā)利用、種植區(qū)域北移具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

在深山含笑種質(zhì)資源利用方面，前人從抗寒性的角度對其在南京地區(qū)的引種適應(yīng)性進行了評價[2]；黃利斌等從實生變異單株中選育出了冠型優(yōu)美、生長迅速的優(yōu)良新品種‘錦繡含笑’(Micheliamaudiae‘Jinxiu’)[3]。園藝育種實踐研究證明，開展雜交育種，是增加品種遺傳多樣性、增強適應(yīng)性、抗逆性，改變花型、花色，提升觀賞性的有效途徑之一。前人已通過含笑屬植物種間雜交培育出適應(yīng)性強、抗逆性好的品種‘晚春含笑’(Michelia‘Wanchunhanxiao’)[4]，綜合親本部分優(yōu)良性狀的品種‘云瑞’[5]，紅花含笑品種‘郁金含笑’、‘丹芯含笑’、‘沁芳含笑’[6]，淡紫紅含笑品種‘夢紫’[7]。育種實踐證明，弄清植物的生殖發(fā)育規(guī)律，是開展雜交育種工作的前提和基礎(chǔ)。該研究擬采用石蠟切片技術(shù)，系統(tǒng)研究深山含笑花發(fā)育過程中大、小孢子發(fā)生和雌、雄配子體的發(fā)育過程，探究其發(fā)育規(guī)律，探討其與木蘭科近緣種生殖發(fā)育的異同，為利用深山含笑開展種間乃至屬間的有性雜交，創(chuàng)制優(yōu)良觀賞花木新種質(zhì)積累資料，同時完善木蘭科植物生殖發(fā)育的胚胎學(xué)資料。

1　材料與方法

1.1　材料

深山含笑花芽采自湖北荊州長江大學(xué)校園，從2016年1月～2017年3月，每隔3～7天采集新鮮花芽備用。

1.2　方法

取深山含笑不同發(fā)育時期的新鮮花芽，用游標卡尺測量其長度及直徑后剝離雌雄蕊，F(xiàn)AA固定液(甲醛∶冰乙酸∶70%乙醇=1∶1∶18)固定，抽真空后固定24 h，50%乙醇潤洗，后依次經(jīng)70%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水，每級2 h；再經(jīng)1/2乙醇+1/2二甲苯、二甲苯透明，每級2 h；38℃條件下放入飽和的石蠟二甲苯溶液中過夜，65℃條件下液態(tài)石蠟中浸蠟12 h，每4 h換1次新蠟；包埋成型。連續(xù)切片，切片厚度8 μm，番紅—固綠對染，中性樹膠封片，SDPTOP BH200光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

2　結(jié)果與分析

2.1　深山含笑春秋兩季花器官形態(tài)發(fā)育比較

比較荊州地區(qū)春秋兩季深山含笑花器官形態(tài)發(fā)育發(fā)現(xiàn)：深山含笑花被片原基在9月花芽長12～18 mm、直徑3.5～5 mm時分化，至10月底，花芽長18～24 mm、直徑5～7 mm時，雄蕊花藥中小孢子母細胞形成，11月底花芽長24～30 mm、直徑7～9 mm時小孢子四分體解體形成單核花粉粒。隨著冬季氣溫的不斷降低，雌雄蕊發(fā)育緩慢甚至休眠。至翌年2月中旬隨著氣溫的回升，花芽發(fā)育迅速，長30～45 mm、直徑9～14 mm時，單核小孢子發(fā)育成二細胞型花粉粒，至2月下旬開花前花粉完全發(fā)育成熟。2月中旬，當(dāng)雄配子發(fā)育成二細胞型花粉粒時，雌蕊子房中胚珠原基開始發(fā)育，至3月中旬花被片與雄蕊完全脫落后，大孢子母細胞才形成，此后雌蕊生長迅速，至4月中旬雌配子發(fā)育成熟。從發(fā)育時間來看，春季最早開花的深山含笑雌配子體晚雄配子體近1個半月成熟。深山含笑花期從2月下旬持續(xù)到4月上旬。春季最晚開花的深山含笑花芽分化開始于3月中旬，由于春季氣溫相對較高，花芽生長迅速，3月下旬芽長已達30～40 mm、直徑9～13 mm，4月上旬開花，雄配子體發(fā)育成熟，此時雌蕊子房中胚珠原基開始發(fā)育，至5月上旬雌配子體發(fā)育成熟。

秋季開花的深山含笑花原基從6月下旬開始分化，初夏氣溫適宜，花芽生長迅速。至7月下旬，花芽長達38～43 mm、直徑8.5～9 mm，由于南方高溫，花芽開始休眠，此時雄蕊花藥中出現(xiàn)孢原細胞或初生造孢細胞。8月中旬隨初秋夜間氣溫的回落，花芽打破短暫的休眠繼續(xù)發(fā)育，雄蕊花藥出現(xiàn)次生造孢細胞或小孢子母細胞時開花，但與休眠前相比，花芽長度及直徑并未顯著增加，花期持續(xù)到9月中旬。秋季開花的深山含笑花粉敗育，雌蕊胚珠珠心中未見大孢子發(fā)育，開花后花瓣雄蕊連同雌蕊一起迅速枯萎，不能正常結(jié)實。

2.2　深山含笑小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育

花藥發(fā)育之初，靠近中心位置一側(cè)的細胞快速分裂，向內(nèi)彎曲，形成兩個小突起(圖版Ⅰ：A)后期分化形成花粉囊。每個突起處中央一個細胞分化形成孢原細胞，孢原細胞經(jīng)平周分裂，形成外層的周緣細胞(初生壁細胞)和內(nèi)層的造孢細胞；隨著花粉囊的發(fā)育，周緣細胞繼續(xù)由外至內(nèi)分裂形成1層藥室內(nèi)壁、2～3層中層和1～2層絨氈層；與此同時，初生造孢細胞也經(jīng)過有絲分裂形成次生造孢細胞(圖版Ⅰ：B)。至10月底，花藥中出現(xiàn)明顯的小孢子母細胞，其核大、生理活動旺盛(圖版Ⅰ：C)。隨后小孢子母細胞通過減數(shù)分裂形成四分體，深山含笑小孢子四分體的排列方式有對稱型、四面體型或交叉型(圖版Ⅰ：D～G)；在小孢子母細胞減數(shù)分裂形成四分體過程中，絨氈層細胞開始解體并為小孢子的發(fā)育提供營養(yǎng)，當(dāng)四分體形成時，絨氈層僅殘留一層細胞，且細胞間出現(xiàn)明顯的間隙(圖版Ⅰ：H)。四分體小孢子最初被包裹在半透明的胼胝質(zhì)中，隨著胼胝質(zhì)的溶解，小孢子從四分體中釋放，剛釋放出來的小孢子呈不規(guī)則三角形，此時殘存的一層絨氈層大部分細胞已解體消失(圖版Ⅰ：I)。翌年2月底，小孢子核進行有絲分裂形成二細胞型花粉，包含一個大的營養(yǎng)核和一個貼于細胞壁處的生殖核，小孢子處在靠邊期，此時中層細胞也大部分解體，僅留殘存的細胞壁骨架(圖版Ⅰ：J)，藥室內(nèi)壁細胞開始徑向變長，帶狀增厚，細胞體積增大，但兩兩相鄰的花粉囊壁處有幾個藥室內(nèi)壁細胞并不增厚，當(dāng)二細胞型花粉繼續(xù)發(fā)育形成成熟花粉粒時，發(fā)生破裂，花粉囊隨之裂開，花粉散出(圖版Ⅰ：K)。

秋季開花深山含笑6月下旬開始花芽分化，雄蕊花藥中小孢子初期發(fā)育正常，至7月下旬，小孢子發(fā)育成孢原細胞或初生造孢時停止發(fā)育，至8月中旬開花后表現(xiàn)出明顯的花粉敗育(圖版Ⅰ：L～M)。

2.3　深山含笑大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育

2月中旬，雌蕊原基基部卷合，在卷合的心皮腹面細胞快速生長形成幾團細胞，進一步發(fā)育成胚珠原基(圖版Ⅱ：A)，3月初，胚珠原基發(fā)育成指狀突起，但同一朵花不同雌蕊內(nèi)的胚珠發(fā)育并不同步，有時同一子房內(nèi)的胚珠發(fā)育也不同步(圖版Ⅱ：B)，3月中旬，孢原細胞出現(xiàn)于珠心組織頂端表皮下，經(jīng)過有絲分裂形成造孢細胞；3月下旬，當(dāng)花瓣與雄蕊完全脫落后，能觀察到明顯內(nèi)外珠被，此時大孢子母細胞生理活動旺盛，細胞核明顯(圖版Ⅱ：C，D)。隨后，大孢子母細胞進行兩次減數(shù)分裂(圖版Ⅱ：E)，形成直線型四分體，合點端的一個發(fā)育成功能大孢子，其余3個退化消失。在大孢子母細胞發(fā)育分化形成功能大孢子過程中，內(nèi)外珠被頂端伸長，至單核時期已在珠孔端愈合；同時，由于胚珠基部的不均衡生長，胚珠逐漸倒生(圖版Ⅱ：F)。單核雌配子體進行有絲分裂形成二核，二核雌配子體的兩個核移向兩端(圖版Ⅱ：G)，隨后進行第2次有絲分裂形成四核，4月中旬，四核雌配子體進行第3次有絲分裂形成八個游離的核，兩端各有一個核向中間靠攏，融合成為具2個核的中央細胞(圖版Ⅱ：H)，合點端的另外3個細胞集合在一起形成3個反足細胞，珠孔端的3個細胞組成卵器，包括1個卵細胞和2個助細胞(圖版Ⅱ：I)，至此，成熟雌配子體形成。從大孢子發(fā)生到雌配子體形成的發(fā)育過程中，胚珠的珠孔一端逐漸彎曲，形成倒生胚珠，雙珠被，厚珠心，深山含笑的雌配子體發(fā)育方式為蓼型。

3　討論

深山含笑花單生，多生于葉腋，偶生于枝頂，雌雄蕊多數(shù)、離生、螺旋狀排列，花藥4室，腺質(zhì)絨氈層，四分體有四面體型、對稱型，偶有交叉型，花粉成熟時為2細胞型。雌蕊成熟時胚珠倒生、雙珠被、厚珠心，大孢子四分體呈直線型排列，雌配子體發(fā)育方式為蓼型?；ǚ劬?個小孢子囊，2細胞花粉，倒生胚珠，雙珠被，厚珠心，蓼型胚囊，合點端大孢子具功能等被認為是比較原始的胚胎學(xué)性狀。深山含笑胚胎發(fā)育與前人對木蘭科其他種胚胎發(fā)育研究結(jié)果相似[8～14]，均表現(xiàn)出原始的特征，體現(xiàn)其胚胎發(fā)育的保守性。

深山含笑春季花期長，花量大，結(jié)實多，早花發(fā)育過程持續(xù)時間長，晚花持續(xù)時間短，雌、雄配子體發(fā)育出現(xiàn)嚴重不同步現(xiàn)象。秋季花期較春季短，花量小，大多不能結(jié)實，整個發(fā)育過程持續(xù)時間短，雌、雄配子體多不能正常發(fā)育成熟。春季最早開花花芽在荊州地區(qū)頭年10月底小孢子母細胞形成，次年2月底形成成熟花粉粒。2月中旬胚珠開始發(fā)育，3月中旬，花被片和雄蕊凋落后，大孢子母細胞才開始形成。深山含笑雌、雄配子體發(fā)育表現(xiàn)出嚴重不同步現(xiàn)象，可能是進化中對異交結(jié)實的一種適應(yīng)。

木蘭科除木蘭屬的木蘭亞屬和玉蘭亞屬之間有較強生殖隔離、沒有雜交親和性外，其他屬內(nèi)都有雜交親和性[15]，前人基于分子系統(tǒng)學(xué)的研究也進一步證明了木蘭屬與含笑屬之間有很近的親緣關(guān)系[16]。屬間雜交研究表明，山玉蘭(MagnoliadelavayiFranch.)與樂東擬單性木蘭(Parakmerialotungensis)雜交結(jié)實率高達90%[17]。同樣，含笑屬內(nèi)雜交也培育出許多適應(yīng)性強，觀賞價值高的含笑屬新品種，如徐海燕等以云南含笑(M.yunnanensisFranch. ex Finet et Gagn.)和南亞含笑(M.shiluensisChun et Y.F.Wu)雜交培育出‘云霞’、‘云馨’和‘云星’含笑，以此雜交后代為母本，以深山含笑為父本雜交培育出‘云瑞’含笑[5]。深山含笑部分種質(zhì)具有花開兩季、花量大、花期長、抗性強等優(yōu)點，異交授粉的結(jié)籽率與座果率顯著高于自交授粉[18]。弄清植物的生殖發(fā)育規(guī)律，是進行雜交育種的前提和基礎(chǔ)，在本研究中，深山含笑雄蕊和花瓣脫落后雌蕊胚珠中才出現(xiàn)大孢子母細胞，但鑒于單株花期長，花量大的特點，雜交育種應(yīng)選取單株早期開花的花朵套袋，盡量避免同株后期花粉的干擾，本研究為深山含笑在荊州地區(qū)的雜交育種工作積累了資料。

圖版Ⅰ　深山含笑小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育　A.形成兩個突起；B.次生壁細胞和次生造孢細胞；C.小孢子母細胞；D.交叉型四分體；E.對稱型四分體；F～G.四面體型四分體；H.加厚的絨氈層；I.剛釋放的小孢子；J.二細胞花粉；K.花粉成熟時雄蕊橫切；L.秋季發(fā)育異常的花粉囊；M.秋季花粉敗育PlateⅠ　Microsporogenesis and development of male gametophytes in M.maudiae Dunn　A. Protuberance; B. The secondary sporogenous cell and the secondary parietal cell; C. Microsporocyte; D. Decussatetetrad; E. Isobilateraltetrad; F-G.Tertrahedroidtetrad; H. Apetum; I. Microspore appeared; J. Two-celled pollen grain; K. Crosscutting at mature pollen stage; L. Dysplasia; M. Abortion

圖版Ⅱ　深山含笑大孢子發(fā)生和雌配子體發(fā)育　A.基部卷合形成突起；B.胚珠發(fā)育不同步；C～D.大孢子母細胞；E.大孢子母細胞有絲分裂；F.單核胚囊；G.二核胚囊；H.中央細胞；I.成熟胚囊PlateⅡ　Megasporogenesis and development of female gametophytes in M.maudiae Dunn　A.Protuberance; B.Ovule development are not synchronized; C-D.Megaspore mother cell; E.Mitosis; F.Mononuclear embryo sac; G.Bi-nucleateembryosac; H.Central cells; I.Mature embryo sac

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