牛美芝，楊輝，劉福壘

（1.山東省肥城礦業(yè)中心醫(yī)院 心內(nèi)科，山東 肥城 271608；2.山東省泰安市中心醫(yī)院，山東 泰安 271000）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┳鳛閲?yán)重威脅人類健康的常見病，近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是其重要的病理基礎(chǔ)[1]，研究表明[2]，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化作為血管壁的一種慢性炎癥疾病，是炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常、血管平滑肌細(xì)胞異常增殖及遷移等共同作用的結(jié)果。有研究指出[3]，血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移異常在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用。趨化素（Chemerin）作為新發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子和脂肪因子，與肥胖、糖脂代謝異常等密切相關(guān)[4]，研究發(fā)現(xiàn)[5]，Chemerin在人冠狀動(dòng)脈周圍脂肪組織及冠狀動(dòng)脈病變部位的血管平滑肌細(xì)胞中高表達(dá)。亦有研究指出[6]，Chemerin與其受體人趨化因子樣受體1（chemokine receptor-like 1，CMKLR1）結(jié)合通過活化下游相應(yīng)信號(hào)通路而參與了冠心病發(fā)生及進(jìn)展過程。本研究通過轉(zhuǎn)染Chemerin基因RNA干擾慢病毒載體，觀察其對小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（aortic smooth muscle cell，ASMC）增殖能力的影響，并探討可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　主要試劑與設(shè)備

SPF級ICR小鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK（豫）2010-0002]，雌雄不限，8～10周齡，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液均購自美國Gibco公司，0.25%胰蛋白酶、Trizol總RNA提取試劑盒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自美國Invitrogen公司，慢病毒表達(dá)載體試劑盒購自日本TaKaRa公司，293T包裝細(xì)胞購自廣州賽業(yè)生物公司，血小板源性生長因子-BB（platelet-derived growth factor，PDGF-BB）購自上海古朵生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒均購自大連寶生物公司，Chemerin及內(nèi)參引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，兔抗小鼠α平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司，小鼠抗大鼠Chemerin單克隆抗體購自美國Enzo Life Sciences公司，兔抗鼠細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）單克隆抗體購自美國Cell Signalling公司，小鼠抗大鼠p-ERK1/2多克隆抗體、鼠抗c-Jun氨基末端激酶（JNK）單克隆抗體購自美國Biosource公司，鼠抗p-JNK單克隆抗體購自上海瑞齊生物科技有限公司，兔抗山羊二抗購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）抗體購自美國Sigma公司，凝膠電泳分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）儀購自美國ABI公司。

1.2　方法

1.2.1Chemerin基因RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建及鑒定根據(jù)小鼠Chemerin基因mRNA序列為干擾靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)其靶向干擾的短發(fā)夾RNA序列（shRNA），正向：5'-GATCCGCTTTGTGAGGTTGGAATTTAATTCAAG AGATTAAATTCCAACCTCACAAAGTTTTTTACGCGT G-3'，反向：5'-AATTCACGCGTAAAAAACTTTGTGAG GTTGGAATTTAATCTCTTGAATTAAATTCCAACCT CACAAAGCG-3'。根據(jù)試劑盒說明書，構(gòu)建利用293T細(xì)胞對慢病毒進(jìn)行包裝，采用梯度稀釋后，利用熒光計(jì)數(shù)對病毒滴度進(jìn)行檢測。

1.2.2小鼠ASMC培養(yǎng)、鑒定及分組利用頸椎脫臼法將小鼠處死，無菌操作下將胸主動(dòng)脈取出，用眼科剪剪成小塊狀，胰酶預(yù)消化后，利用組織塊貼壁法對ASMC進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并采用免疫熒光法對ASMC進(jìn)行鑒定。取傳代培養(yǎng)細(xì)胞，分成4組：Sham組、PDGF組、對照序列組和Chemerin沉默組，其中，Chemerin沉默組和對照序列組分別用攜帶Chemerin干擾基因和對照基因序列的慢病毒進(jìn)行感染，分別向PDGF組、對照序列組和Chemerin沉默組細(xì)胞中加入終濃度為20 ng/ml的PDGF-BB，Sham組則加入等量的PBS。

1.2.3qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中Chemerin基因表達(dá)取各組傳代培養(yǎng)48 h細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用Trizol總RNA提取試劑盒對總RNA進(jìn)行提取，用紫外分光光度計(jì)對總RNA純度進(jìn)行檢測，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得模板單鏈cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。引物序列：Chemerin引物，正向：5'-TACAGGTG GCTCTGGAGGAGTTC-3'，反向：5'-CTTCTCCCGTTTG GTTTGATTG-3'；β-actin 引物，正向：5'-AGCCATGTA CGTAGCCATCC-3'，反向：5'-CTCTCAGCTGTGGTGGT GAA-3'。PCR 反應(yīng)條件：92℃ 1 min，92℃ 30 s，58℃30 s，73℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行 40次循環(huán)。用2-△△Ct法獲得各組細(xì)胞中Chemerin基因相對表達(dá)量。

1.2.4細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)取各組細(xì)胞，胰酶消化后離心，接種于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，每組設(shè)置6個(gè)反應(yīng)復(fù)孔，4～6 h后改用100μl完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在加入PDGF-BB后培養(yǎng)48 h時(shí)，去除培養(yǎng)基，用含EDTA的胰酶30μl消化后，加入培養(yǎng)液70μl，充分吹打，使細(xì)胞充分混合均勻，取細(xì)胞懸液10μl，于顯微鏡下利用計(jì)數(shù)板對各組細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5BrdU摻入法測定各組細(xì)胞增殖能力取各組傳代培養(yǎng)48 h細(xì)胞，接種于96孔板，將10μmol/L的BrdU溶液加入各孔，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h，將200μl的FixDenant溶液加入，室溫下孵育25 min，于2 000 r/min離心10 min，棄上清，將100μl的抗BrdU-POD工作液加入，室溫下孵育100 min，于2 000 r/min離心10 min，棄上清，緩沖液反復(fù)沖洗3次，棄上清，將100μl的底物溶液加入，室溫下孵育25 min，將25μl的H2SO4溶液加入，于400 r/min離心2 min，于20 min內(nèi)利用酶標(biāo)儀取450 nm波長對吸光度（A）值進(jìn)行檢測。

1.2.6Western blot檢測各組細(xì)胞中Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)取各組傳代培養(yǎng)48 h細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，用總蛋白提取試劑盒對總蛋白進(jìn)行提取，用BCA蛋白檢測試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行檢測。取30μg蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉120 min，分別將小鼠抗大鼠Chemerin單克隆抗體、兔抗鼠細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）單克隆抗體、小鼠抗大鼠p-ERK1/2多克隆抗體、鼠抗JNK單克隆抗體和鼠抗p-JNK單克隆抗體（稀釋比例：1∶800、1∶1 200、1∶1 000、1∶500和1∶800）加入，4℃下過夜孵育，用TBST洗滌3次，將二抗加入，室溫下孵育60 min，TBST洗滌3次，用ECL發(fā)光試劑盒避光反應(yīng)30 min，利用Image J圖像分析軟件對獲得的條帶進(jìn)行分析，獲得各組細(xì)胞中 Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK 和 p-JNK蛋白相對表達(dá)量。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　小鼠ASMC培養(yǎng)及慢病毒感染檢測結(jié)果

顯微鏡下觀察，小鼠ASMC呈不規(guī)則形、三角形或長梭形，體積較小，見圖1A；沉默組和對照序列組小鼠ASMC分別轉(zhuǎn)染Chemerin基因感染序列和陰性對照序列后，培養(yǎng)48 h，熒光顯像觀察可見綠色熒光達(dá)90%以上，見圖1B，提示ASMC細(xì)胞慢病毒感染成功。

2.2　各組細(xì)胞中Chemerin基因表達(dá)比較

圖1　小鼠ASMC培養(yǎng)及慢病毒感染檢測結(jié)果

qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中Chemerin表達(dá)水平，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=172.943，P=0.000），各組Chemerin表達(dá)水平有差異；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與Sham組相比，對照序列組和PDGF組Chemerin mRNA相對表達(dá)量均增高（t=31.173和29.351，均P=0.000），Chemerin沉默組Chemerin mRNA相對表達(dá)量降低（t=16.817，P=0.000）。與對照序列組和PDGF組相比，Chemerin沉默組Chemerin mRNA相對表達(dá)量均降低（t=45.183和42.953，均P=0.000），見圖 2。

圖2　各組細(xì)胞中Chemerin基因表達(dá)

2.3　各組細(xì)胞增殖能力比較

細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)顯示，Chemerin沉默組、對照序列組、PDGF組和Sham組細(xì)胞數(shù)分別為（34.27±3.08）×103個(gè) /cm2、（58.62±3.71）×103個(gè) /cm2、（61.35±4.16）×103個(gè) /cm2和（46.14±2.95）×103個(gè) /cm2，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=208.318，P=0.000），各組細(xì)胞數(shù)有差別；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與Sham組相比，對照序列組和PDGF組細(xì)胞數(shù)均增加（t=46.826和48.617，均P=0.000），而Chemerin沉默組細(xì)胞數(shù)降低（t=19.381，P=0.000）；與對照序列組和PDGF組相比，Chemerin沉默組細(xì)胞數(shù)均降低（t=61.291和 64.064，均P=0.000）。

BrdU摻入法結(jié)果顯示，Chemerin沉默組、對照序列組、PDGF組和Sham組吸光度A值分別為（1.26±0.07）、（1.58±0.09）、（1.57±0.10）和（1.43±0.08），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.164，P=0.000），各組細(xì)胞吸光度A值有差別；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與Sham組相比，對照序列組和PDGF組吸光度A值均增加（t=10.517和10.483，均P=0.000），而Chemerin沉默組吸光度A值降低（t=13.067，P=0.000）；與對照序列組和PDGF組相比，Chemerin沉默組吸光度A值均降低（t=16.862和16.798，均P=0.000）。

2.4　各組細(xì)胞中 Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)比較

Western blot檢測各組細(xì)胞中Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)水平，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=39.167、48.375、31.272、56.759和 40.391，均P=0.000），各組細(xì)胞中 Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK 和 p-JNK蛋白表達(dá)水平有差別；進(jìn)一步兩兩比較顯示，與Sham組相比，對照序列組和PDGF組Chemerin、p-ERK1/2、p-JNK灰度均增高（t=26.842、27.167、20.572、19.883、11.057 和 10.837，均P=0.000），而ERK1/2、JNK灰度均降低（t=29.382、29.168、32.672和32.405，均P=0.000）；與Sham組相比，Chemerin沉默組Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK灰度均降低（t=13.286、12.195、7.235、11.836和10.672，P=0.000、0.000、0.001、0.000 和 0.000）；與對照序列組和PDGF組相比，Chemerin沉默組Chemerin、p-ERK1/2、p-JNK灰度均降低（t=37.268、38.173、11.971、11.684、31.824和 32.174，均P=0.000），而ERK1/2、JNK 灰 度 均 增 加（t=13.082、13.574、13.582和14.015，均P=0.000），見圖3和附表。

圖3　各組細(xì)胞中Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)

附表　各組細(xì)胞中Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)比較 （±s）

附表　各組細(xì)胞中Chemerin、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK蛋白表達(dá)比較 （±s）

注：1）與Sham組相比，P ＜0.05；2）與PDGF組相比，P ＜0.05；3）與對照序列組相比，P ＜0.05

組別　Chemerin蛋白　ERK1/2蛋白　p-ERK1/2蛋白　JNK蛋白　p-JNK蛋白Sham 組　0.48±0.06　0.63±0.08　0.48±0.09　0.69±0.11　0.54±0.07 PDGF 組　0.69±0.101）　0.36±0.101）　0.62±0.111）　0.40±0.091）　0.66±0.091）對照序列組　0.71±0.121）2）　0.37±0.111）2）　0.64±0.141）2）　0.42±0.121）2）　0.65±0.101）2）Chemerin 沉默組　0.32±0.091）2）3）　0.49±0.091）2）3）　0.39±0.101）2）3）　0.57±0.101）2）3）　0.43±0.081）2）3）F值　39.167　48.375　31.272　56.759　40.391 P值　0.000　0.000　0.000　0.000　0.000

3　討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化作為冠心病和冠心病介入治療術(shù)后再狹窄發(fā)生的共同病理基礎(chǔ)，對患者生命健康造成嚴(yán)重影響[7]。該病發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全清楚。Chemerin作為新近發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，廣泛存在于機(jī)體組織中，與肥胖相關(guān)疾病發(fā)生及糖脂代謝失衡密切相關(guān)[8]。有研究指出[9]，冠心病患者血漿Chemerin水平升高，且與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。研究表明[10]，Chemerin與存在于人血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異性CMKLR1結(jié)合可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管新生。而血管平滑肌細(xì)胞異常增殖在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及血管重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[11]。亦有研究指出[12]，動(dòng)脈粥樣斑塊增殖中Chemerin呈高表達(dá)。這些研究表明Chemerin可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及進(jìn)展過程，但具體機(jī)制尚不明確。

本研究利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建Chemerin基因缺陷慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染小鼠ASMC，結(jié)果顯示，小鼠ASMC被成功分離培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡觀察可見綠色熒光達(dá)90%以上，提示ASMC細(xì)胞慢病毒感染成功。本研究利用PDGF-BB對小鼠ASMC進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，PDGF-BB可促進(jìn)小鼠ASMC增殖。本研究結(jié)果顯示，Chemerin沉默組細(xì)胞中Chemerin基因和蛋白相對表達(dá)量均低于對照序列組、PDGF組和Sham組，進(jìn)一步說明Chemerin沉默組細(xì)胞中Chemerin基因被抑制。細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)和BrdU摻入法結(jié)果均顯示，Chemerin沉默組細(xì)胞數(shù)和吸光度A值均降低，表明Chemerin與小鼠ASMC增殖密切相關(guān)，抑制Chemerin基因表達(dá)可抑制ASMC增殖能力。

研究表明[13]，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移等多種細(xì)胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。MAPK信號(hào)活化可促進(jìn)自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖[14]，阻斷MAPK信號(hào)通路可抑制動(dòng)脈損傷后血管平滑肌細(xì)胞增殖[15]。ERK1/2和JNK通路是MAPK信號(hào)通路中重要組成部分，與細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程密切相關(guān)[16]。本研究顯示，Chemerin沉默組細(xì)胞中ERK1/2和JNK蛋白相對表達(dá)量均高于對照序列組和PDGF組，而低于Sham組，Chemerin沉默組細(xì)胞中p-ERK1/2和p-JNK蛋白相對表達(dá)量均低于對照序列組、PDGF組和Sham組，而對照序列組和PDGF組均高于Sham組，說明Chemerin沉默組細(xì)胞中ERK1/2和JNK信號(hào)通路被抑制，提示沉默Chemerin基因阻止小鼠ASMC增殖可能與抑制ERK1/2和JNK信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，特異性沉默Chemerin基因可阻止ASMC的增殖作用，其機(jī)制可能與抑制ERK1/2和JNK信號(hào)通路有關(guān)，為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制研究提供了一定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為該病基因防治提供了潛在靶點(diǎn)。

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