吳偉，謝洪武，謝亮，黃孝天，謝鵬

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，江西 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院針灸康復(fù)科，江西 南昌 330006；3.南昌大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330006；4.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016）

博爾納病毒（borna disease virus, BDV）是一種以非細胞溶解性，負鏈單股RNA為特點的嚴格的嗜神經(jīng)病毒，其自然感染以馬和羊為主，可能通過內(nèi)源性干擾素和介導(dǎo)磷蛋白酶等環(huán)節(jié)參與[1-2]。在我國一些地域已有散在報道[3-5]，但江西及周邊環(huán)鄱陽湖地區(qū)尚未系統(tǒng)性研究。鄱陽湖是世界上最大的鳥獸類保護區(qū)之一，BDV與病毒性腦炎（virus encephalitis，VE）、多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）、吉蘭-巴雷綜合征（guillain barre syndrome，GBS）、帕金森（parkinson disease，PD）等神經(jīng)精神類疾病密切相關(guān)[6]。因此，本實驗采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測該地區(qū)患者、健康受試者以及山羊外周血液中BDV p24，進行相關(guān)比較研究[7-10]。

1　資料與方法

1.1　研究對象

選取2008年8月-2013年8月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院及門診的患者。所有研究對象系地處江西及其周邊地區(qū)。①30例VE患者，通過其臨床表現(xiàn)、腦脊液和血液常規(guī)生化檢測，以及細胞學(xué)、腦電圖、影像學(xué)等檢查，確診為VE，并行單純皰疹病毒、EB病毒等的特異性抗體檢測，篩選剔除經(jīng)病原學(xué)診斷不明確者。其中男性20例，女性10例；年齡20～45歲，平均（28.7±4.3）歲。②10例臨床確診MS患者，男性6例，女性4例；年齡18～46歲，平均（28.4±3.7）歲。③10例臨床確診GBS患者，男性7例，女性3例；年齡20～48歲，平均（29.2±3.4）歲。④10例臨床確診PD患者，男性5例，女性5例；年齡46～74歲，平均（62.1±4.3）歲。選取江西及其周邊地區(qū)健康且自愿獻血的對照組患者60例，男性38例，女性32例；年齡20～55歲，平均（34.7±3.6）歲。采集江西及其周邊地區(qū)60只山羊外周血液單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）。

1.2　主要試劑和儀器

引物和熒光探針序列由中山大學(xué)達輝基因診斷中心合成，從GenBank中調(diào)取出BDV的第二開放閱讀框（ORFⅡ）區(qū)的序列，根據(jù)引物設(shè)計的原則，設(shè)計擴增BDV p24基因片段的引物序列。

外引物為正向引物：5'-TGACCCAACCAGTAGAC CA-3'（nt 1 443～146 119 bp），反向引物：5'-GTCCCAT TCATCCGTTGTC-3'（nt 1 816～183 419 bp）。內(nèi)引物為設(shè)計正向引物：5'-CCCTCCAAGTGGAAACCAT-3'（nt 1 609～161 719 bp），設(shè)計反向引物：5'-CAGTATCTTG ATGTTCTCGCCA-3'（nt 1 673～169 422 bp）。設(shè)計熒光探針：5'-FAM-TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGCTAMRA-3'（nt 1 637～166 125 bp），5'標(biāo)記物為 6- 羧基熒光素，3'標(biāo)記物為4-甲基羅達明，其擴增的目的基因片段長度是86 bp。其中ABI7500的熒光定量PCR儀器系美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司出產(chǎn)。

1.3　方法

1.3.1提取目的細胞的RNA每例研究對象的外周血液標(biāo)本嚴格按操作規(guī)程采集5 ml，用Ficoll-conray液分離出PBMC，然后用TriPure RNA提取試劑盒（德國Boehring-Mannheim公司）提取目的細胞總的RNA物質(zhì)，再將標(biāo)本置于-70℃冰箱中保存[3-5]。

1.3.2巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（nRT-PCR）及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）在進行常規(guī)nRT-PCR操作時，在第2輪行擴增PCR反應(yīng)的混合物體系中加入特異性寡核苷酸探針（熒光基團標(biāo)記）而行qRT-PCR反應(yīng)。首先進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作，取反應(yīng)體積系11μl，其含逆轉(zhuǎn)錄體系的9μl、外引物1對各0.5μl，予以逆轉(zhuǎn)錄酶的MMLV 1μl，在37℃恒溫持續(xù)1 h后，95℃ 3 min行滅活逆轉(zhuǎn)錄酶操作。取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后的反應(yīng)液10μl，加外引物1對各1μl，dNTP 物 1μl，濃度為 25 mmol/L 的 MgCl2溶液 10μl，取Taq DNA聚合酶2μl，其總體反應(yīng)體積為50μl。過程中的第1輪PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min時間，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸7 min；而第2輪PCR反應(yīng)體積系50μl，其中含第一輪擴增產(chǎn)物5μl，dNTP物1μl，Taq DNA聚合酶2μl，濃度為25 mmol/L的MgCl2溶液10μl，內(nèi)引物1對各1μl，目的熒光探針lμl[3-5]。反應(yīng)體系的條件：93℃預(yù)變性2 min，93℃變性45 s時間，55℃退火1 min，共10個循環(huán)；93℃變性30 s，55℃退火45 s，共30個循環(huán)。β-actin系小分子蛋白物，特點是易于擴增，因此檢測每份標(biāo)本的同時予以檢測阻β-actin作為內(nèi)參對照，以證明其參與反應(yīng)的RNA完整性，并且每次實驗設(shè)陰性對照以明確區(qū)分[3-5]。

1.3.3目的BDV p24基因的cDNA片段克隆與測序 在陽性PCR反應(yīng)產(chǎn)物中用醋酸鈉、乙醇沉淀法純化后與目的T載體相連接，進而轉(zhuǎn)化成目的大腸埃希菌，并采用公認的藍白斑及菌落qRT-PCR鑒定法篩選目的基因的重組子，在每一標(biāo)本操作的同時收集其陽性菌落進行培養(yǎng)。集菌中提取質(zhì)粒DNA，然后再用qRT-PCR方法進行鑒定操作，并把陽性質(zhì)粒重組子送至廣東省廣州市達輝生物工程有限公司進行測序鑒定明確[3-5]。

1.4　統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗或Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　nRT-PCR和qRT-PCR擴增PBMC中BDV p24基因片段的檢測結(jié)果

神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的PBMC中BDV p24基因片段的檢出率為15.00%（9/60），其中VE患者為20.00%（6/30）、MS患者為30.00%（3/10），但在GBS和PD患者及健康受試者中均未檢出，山羊的BDV p24基因片段陽性率為1.67%（1/60）。VE和MS患者與健康受試者的PBMCs BDV p24基因片段檢出率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），VE和MS患者高于健康受試者。山羊目的BDV p24基因片段的陽性率為1.67%，與健康受試者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見附表。

附表　PBMC BDV p24基因片段檢出率比較

2.2　陽性PCR反應(yīng)產(chǎn)物BDV p24基因片段的目的序列測定及其同源性

測序的結(jié)果經(jīng)BLAST軟件分析后證明其確實系目的BDV p24基因片段，而與GenBank所提供的馬源性標(biāo)準毒株比較，VE患者和MS患者目的BDV p24基因片段測序的結(jié)果相一致，而與strain V毒株同源性比較為95.73%，其中有3個基因位點出現(xiàn)一致性的沉寂突變（nt 1650T-C位點、nt 1671C-T位點、nt 1692C-A位點，其突變率為3.13%）；而與BDV/MDCK毒株同源性比較為97.89%，其有2個基因位點出現(xiàn)一致性的沉寂突變（nt 1674C-T位點、nt 1677T-C位點，其突變率為2.09%）；而與C6BV毒株比較有2個基因位點出現(xiàn)一致性的沉寂突變（nt 1659T-C位點、nt 1671C-T位點，其突變率為2.13%）。山羊中目的BDV p24基因片段測序的結(jié)果與GenBank所提供的strain V毒株同源性比較為95.72%，其有3個基因位點出現(xiàn)一致性的沉寂突變（nt 1609C-A位點、nt 159T-C位點、nt1661C-T位點，其突變率為3.16%），與BDV/MDCK毒株同源性比較為96.38%，其有3個基因位點出現(xiàn)一致性的沉寂突變（nt 1609 A-C位點、nt 1674 C-T位點、nt 1677 T-C位點，其突變率為3.18%）；與C6BV毒株同源性比較為96.49%，其有3個基因位點出現(xiàn)一致性的沉寂突變（nt 1609 C-A位點、nt 1659 T-C位點、nt 1661 C-T位點，其突變率為3.12%），但其所編碼的氨基酸并沒有實質(zhì)性改變。山羊中目的BDV p24基因片段測序與GenBank所提供strain V毒株、BDV/MDCK毒株、C6BV毒株相互比較，同源性極高，均＜95.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.967），提示其所編碼的氨基酸未有實質(zhì)性的改變。山羊中的BDV p24基因片段測序與GenBank所提供strain V毒株、BDV/MDCK毒株、C6BV毒株同源性比較極高且均＜95.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.962），其所編碼的氨基酸未有實質(zhì)性的改變。見圖1。

2.3　BDV的系統(tǒng)發(fā)生樹分析

應(yīng)用Clustal X 1.83軟件，把所測得的VE、MS患者和山羊的PBMC3者目的基因序列與GenBank所提供的國內(nèi)外30個病毒毒株進行序列比較，繪制BDV的系統(tǒng)發(fā)生樹。3者的基因序列目的基因片段和strain V、BDV/MDCK、C6BV毒株核苷酸序列的親緣關(guān)系最近，同源性分別為95.72%、96.38%和96.49%。見圖2。

2.4　研究對象所采集神經(jīng)系統(tǒng)疾病、健康受試者及山羊區(qū)域空間分布

盡管本實驗研究的樣本含量較小，但基本能反映江西及周邊環(huán)鄱陽湖地區(qū)區(qū)域的樣本特點。見圖3。

圖1　VE、MS患者、山羊與馬的目的BDV p24核苷酸序列（86 bp）比較

圖2　BDV的系統(tǒng)發(fā)生樹

圖3　研究對象所采集神經(jīng)系統(tǒng)疾病、健康受試者及山羊區(qū)域空間分布

3　討論

近年在我國部分地區(qū)的VE、PD、GBS等神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的血液和腦脊液中均檢測出BDV p24基因片段[3-5]。在現(xiàn)有的各種檢測方法中，病毒分離法被公認為金標(biāo)準，但感染BDV時病毒含量很低，需要新鮮的腦組織，操作費時費力，極不利于臨床普遍篩查和流行病學(xué)的統(tǒng)計；而p24具有較高的可操作性、敏感性、特異性、簡便性、快捷性及重復(fù)性，且常規(guī)實驗前無需對標(biāo)本進行加熱滅活或特殊的吸收處理等復(fù)雜的過程，能夠快速而準確地監(jiān)測整個感染進程，及時準確地說明這些疾病患者是否確實存在BDV感染的情況。我國對BDV的研究尚屬起步階段，尚需密切深入開展BDV感染的分子流行病學(xué)、臨床流行病學(xué)和現(xiàn)場調(diào)查等方面的研究，為預(yù)防和控制BDV的暴發(fā)或流行提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)、技術(shù)支撐[3-5]。nRTPCR和qRT-PCR檢測研究對象的血中病毒RNA，采用的是熒光技術(shù)并實行完全閉的管式操作，能極大地減少擴增產(chǎn)物被污染的機會，提高檢測的特異性和敏感性，在用于BDV檢測方面具備較高的研究和使用價值[7-10]。

本研究采用nRT-PCR和qRT-PCR技術(shù)檢測江西及周邊地區(qū)8個縣（市）在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的VE、MS、GBS患者及與之相匹配地區(qū)的山羊PBMC。研究對象所屬區(qū)域限于客觀條件，樣本含量較小，但基本能反映江西及周邊地區(qū)流行病地域特征，檢測的結(jié)果與國內(nèi)外的同時期實驗結(jié)果比較，江西及周邊地區(qū)人BDV的感染率增高[7-10]。分析可能主要與以下因素有關(guān)：①RNA提取或保存過程中，降解產(chǎn)物而出現(xiàn)假陰性；②實施nRT-PCR和qRT-PCR過程中擴增引物出現(xiàn)一定的污染。BDV的感染具有一定的地域性，不同的地區(qū)感染率可能不同，感染存在動物疫源性等特點[11-12]。江西及周邊地區(qū)以農(nóng)業(yè)發(fā)展為主，地處環(huán)鄱陽湖地域，禽獸類物種豐富，每年從俄羅斯西伯利亞、蒙古、日本、朝鮮以及中國東北、西北等地的大批外源性動物遷徙來此過冬。周圍地區(qū)的人與動物的接觸較多且衛(wèi)生條件相對較差，因此人發(fā)生感染的機會相對較大。山羊中BDV p24陽性基因片段的檢出率比其他動物如綿羊、馬和牛較低，可能是該地區(qū)的山羊自然感染率低的原因，一定程度上也說明其存在地區(qū)和物種差異。從測序的結(jié)果看，VE和MS患者的BDV p24基因陽性片段序列相同，與GenBank提供的strain V、BDV/MDCK、C6BV毒株核苷酸序列親緣關(guān)系具有高度的同源性，而山羊的BDV p24基因陽性片段序列和VE、MS患者同源性配比率高，突變率低，且編碼的氨基酸沒有實質(zhì)性改變。雖然BDV的生物學(xué)標(biāo)志研究中已發(fā)現(xiàn)許多值得重視和期待的指標(biāo)，但是BDV本身就是一種由多種因素所導(dǎo)致的臨床復(fù)雜現(xiàn)象，不僅受到一些相關(guān)因素的影響和作用，而且又有多個系統(tǒng)的相互協(xié)調(diào)，目前相關(guān)研究大多數(shù)局限于針對某一個方面進行深入的探討，樣本含量較小，且所得結(jié)果不盡一致，有時還相互矛盾。

從系統(tǒng)分析樹的分析表明VE患者、MS患者和山羊的PBMC目的基因片段同德國的strain V來源于1個分支，說明BDV的流行有地域的局限性，但山羊尚可能存在BDV自然疫源性感染，而人感染BDV具有動物源性[11-12]。本研究還表明，BDV可能是新發(fā)感染性疾病中的一種病原體，與人類某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生可能存在密切關(guān)系，因此對BDV的分子流行病學(xué)的研究有著重要的臨床意義，如果不加以重視BDV的流行生物學(xué)行為，將可能給人類和動物造成不可預(yù)知的風(fēng)險。通過這方面的初步探索工作，對江西及周邊地區(qū)某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者中BDV感染情況作出一個比較粗淺的流行病學(xué)調(diào)查，BDV可能存在動物源性，博爾納病是病毒性的傳染病，考慮通過完善其抗原、抗體檢測而進行疫苗的接種和預(yù)防，但是博爾納病的人工免疫接種方法目前尚未取得成功，考慮到其以細胞免疫機制介導(dǎo)為主，弱毒疫苗研制具有一定的應(yīng)用前景。進一步的抗原、抗體檢測，如抗原陽性提示急性期感染，應(yīng)予以相應(yīng)的抗病毒治療，研究中的樣本應(yīng)繼續(xù)擴大，將抗原、抗體、循環(huán)免疫復(fù)合物同時檢測，為臨床的診斷及指導(dǎo)治療提供更有力的依據(jù)。因此，在以后的研究過程當(dāng)中，當(dāng)進一步增加樣本含量，改善或杜絕因檢測技術(shù)的異質(zhì)性所帶來的影響，用系統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)的方法，研究多個系統(tǒng)之間或系統(tǒng)內(nèi)部多個因素之間的相互關(guān)系，再與神經(jīng)影像學(xué)和分子生物學(xué)等最新的技術(shù)有機結(jié)合盡可能地揭示其發(fā)病的機制。

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