陳佳，楊曉龍，張旭峰

（上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院1.急診科，2.重癥醫(yī)學科，3.檢驗科，上海 201203）

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是導致心肌梗死、心絞痛、冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?、腦梗死等心腦血管疾病的主要原因[1-3]。目前研究已證實氧化應激誘導血管炎癥改變，引起的局部血管炎癥反應和細胞過度增殖參與了AS的發(fā)生和進展。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是機體抵抗氧自由基損傷的主要防御體系，其中細胞外SOD（extracellular superoxide dismutase，EC-SOD）是唯一在細胞外分布并發(fā)揮抗氧化功能的酶[4-6]，也是血管壁抗氧化酶的主要來源。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾方式，參與了AS的發(fā)病和局部炎癥反應。盡管如此，目前依然無法確定長期持續(xù)性血脂異常所誘導的表觀遺傳改變，特別是EC-SOD甲基化，是否與AS的發(fā)病有關。鑒于此，本研究通過復制高脂飲食純合子載脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E-knockout，ApoE-/-）小鼠模型和THP-1單核細胞源性巨噬細胞，觀察EC-SOD甲基化與AS的關系及可能作用靶點，旨在為AS的防治提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1　試劑與抗體

RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、二甲基亞砜、胎牛血清、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自廣州碧云天生物技術研究所，Trizol試劑、逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，pEGFP-N1-DNMT1重組質(zhì)粒委托上海捷瑞生物工程有限公司合成，DNA提取試劑盒、MMLV逆轉錄酶、dNTP、Taq DNA聚合酶、瓊脂糖購自美國Promega公司，THP-1單核細胞株、大腸桿菌DH5α購自上海撫生實業(yè)有限公司，基因引物由上海生工公司合成，丙烯酰胺、PVDF膜、十二烷基硫酸鈉購自美國Sigma公司。DNA甲基轉移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）、SOD3抗體、β-actin小鼠單克隆抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的羊抗兔子IgG二抗購自美國Santa Cruz公司，丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒均購自上海心語生物科技有限公司。

1.2　動物分組與處理

16只雄性ApoE-/-實驗小鼠（ApoE-/-組）和16只C57BL/6小鼠（WT組）購自北京大學實驗動物中心[許可證號：SYXK（京）2016-0028]，8周齡，體重18～22 g，標準化飼養(yǎng)房飼養(yǎng)[SPF級動物房，12 h光照與12 h黑暗循環(huán)，相對濕度40%～70%，溫度（22±2）℃]。普通飼料配方：麩皮25%，玉米25%，豆餅13%，大麥20%，魚粉6%，其他輔料11%；高脂飼料配方：在普通飼料中加入5%脂肪、1.5%膽固醇、5%蛋黃粉和0.2%膽酸鈉。WT組給予不含任何高脂成分的普通飼料喂養(yǎng)，ApoE-/-組給予高脂飼料喂養(yǎng)，小鼠自由攝食和飲水20周后，進行后續(xù)實驗。

1.3　細胞培養(yǎng)、分組與處理

THP-1單核細胞株接種于RPMI-1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，當細胞貼壁生長、且出現(xiàn)偽足時，提示已經(jīng)分化為巨噬細胞。將細胞分為3組：空白對照組（NC組）、空白質(zhì)粒組（pEGFP-N1組）和重組質(zhì)粒組（pEGFP-N1-DNMT1組）；取分化為巨噬細胞的THP-1細胞株，NC組用含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，pEGFP-N1組加入10μl脂質(zhì)體Lipofectamine和20μg空質(zhì)粒載體pEGFP-N1，pEGFP-N1-DNMT1組加入10μl脂質(zhì)體Lipofectamine和20μg pEGFP-N1-DNMT1重組質(zhì)粒載體，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，每6 h更換1次培養(yǎng)液，各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，進行后續(xù)實驗。

1.4　動物處理與取樣

兩組于喂養(yǎng)第8、12、16、20周時，每次每組取4只小鼠，腹腔注射2 ml/100 g麻醉，置于動物手術臺上，摘除眼球，取眼眶靜脈血3 ml，靜置20 min，5 000 r/min離心15 min，吸取上清液，置于-20℃冰箱保存待檢。再將小鼠處死，開腹取出主動脈，生理鹽水沖洗干凈，切取距主動脈弓0.5 cm處的主動脈，分為2部分，一部分采用4%多聚甲醛固定，其余部分于液氮中保存。

1.5　檢測指標

1.5.1血脂檢測 采用全自動生化分析儀檢測小鼠低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、三酰甘油（Triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）等血脂水平，其中LDL、HDL采用常規(guī)酶法，TG、TC采用終點法。

1.5.2組織形態(tài)學觀察取4%多聚甲醛固定的主動脈組織，石蠟包埋，制成4μm的連續(xù)切片，采用蘇木素-伊紅染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察組織形態(tài)學特征。

1.5.3氧化應激指標檢測取4μg組織樣本，勻漿器中打成勻漿，12 000 r/min離心15 min，取上清液待測。采用分光光度比色法檢測主動脈組織MDA、ROS含量，所有樣本均于酶標儀上檢測560 nm處吸光度值，采用標準曲線計算出待測樣品蛋白的濃度。

1.5.4RT-PCR檢測主動脈組織EC-SOD、DNMT1 mRNA水平液氮中取出主動脈組織，自然解凍，Trizol RNA提取試劑盒提取組織總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA濃度。將1μg總RNA按照GeneAmp PCR試劑盒說明書逆轉錄成cDNA；合成體系：逆轉錄緩沖液3μl，RNA逆轉錄模板1μl，逆轉錄酶2μl，正向、反向引物各1μl，加入雙蒸水補充至總反應體系為20μl，37℃金屬浴反應50 min合成cDNA。將cDNA置于PCR反應體系中進行擴增（引物序列見附表）。PCR反應體系：PCR試劑混合液12.5μl，DEPC 8μl，cDNA 2.5μl，正反向引物 1μl，總反應體系25μl；反應條件：95℃預變性1 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)后72℃ 5 min，溶解曲線條件為55℃～95℃，將PCR產(chǎn)物置于瓊脂糖凝膠電泳分離擴增片段，檢測基因熒光信號強度值（Ct），計算基因表達量（2-△△Ct），以β-actin作為內(nèi)參照進行校正，分析目的基因相對表達量。

附表　引物序列及擴增片段長度

1.5.5巢式甲基化特異性PCR檢測主動脈組織ECSOD DNA甲基化程度DNA提取試劑盒提取組織總RNA，4%瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA濃度和純度。PCR反應體系：Power SYBR Green PCR Master Mix10μl，引物 1μl，DNA 模板 2.5μl，ddH2O 15μl。第1輪PCR采用外側引物，反應條件：95℃預變性5 min，97℃變性30 s，56℃退火30 s，總計35個循環(huán)。將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍，取1μl進行第2輪PCR反應，95℃預變性5 min，97℃變性30 s，62℃退火15 s，總計35個循環(huán)。陰性對照為人外周血淋巴細胞，將PCR產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察結果，甲基化%=甲基化光密度值/（甲基化光密度值+非甲基化光密度值）×100%。

1.5.6Western blot檢測EC-SOD、DNMT1蛋白水平和EC-SOD DNA甲基化程度取出對數(shù)生長期細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入離心管中，再加入1 ml細胞裂解液置于冰浴上裂解30 min，4℃條件下離心15 min，采用Western blot檢測EC-SOD、DNMT1蛋白水平，將20μg蛋白提取液置于10%SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)濕法轉膜，加入5%脫脂牛奶孵育封閉2 h。加入鼠抗人EC-SOD單克隆抗體、兔抗人DNMT1單克隆抗體，4℃孵育24 h。再滴加FITC標記的二抗37℃孵育2 h。PBS沖洗3次，按照ECL化學發(fā)光顯影試劑盒顯影，以β-actin作為內(nèi)參照，分析目的條帶相對表達量。各組細胞EC-SOD DNA甲基化程度方法同上。

1.6　統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1　血脂水平變化

第 8、12、16、20周，ApoE-/-組 TC（見圖 1A）、LDL（見圖1B）、TG（見圖1C）呈升高趨勢（F=3.140、4.183 和 4.920，P=0.041、0.033 和 0.029），HDL（見圖1D）無明顯變化（F=0.735，P=0.955）；各時段ApoE-/-組TC、LDL、TG高于WT組，HDL低于WT組（P＜0.05）。

圖1　兩組血脂比較

2.2　主動脈病理形態(tài)變化

第16、20周，WT組動脈組織內(nèi)皮細胞結構規(guī)則有序，平滑肌細胞排列整齊，內(nèi)皮下無炎癥細胞或脂質(zhì)沉積；ApoE-/-組主動脈內(nèi)膜明顯增厚，血管壁伴有彌漫性隆起，平滑肌細胞排列無序，內(nèi)皮下伴有炎癥浸潤和脂質(zhì)沉積。見圖2。

2.3　氧化應激指標變化

第 8、12、16、20周，ApoE-/-組MDA（見圖 3A）、ROS（見圖3B）呈升高趨勢（F=8.143和9.224，P=0.021和0.019），各時段ApoE-/-組MDA、ROS高于 WT 組（P＜0.05）。

2.4　EC-SOD、DNMT1 mRNA及 EC-SOD甲基化水平變化

第 8、12、16、20 周，ApoE-/-組 EC-SOD mRNA（見圖4A）表達水平低于WT組（F=17.320，P=0.000），DNMT1 mRNA表達水平（見圖4B）和EC-SOD甲基化水平（見圖4C）高于WT組（F=16.477和4.965，P=0.001和 0.024）。

2.5　pEGFP-N1-DNMT1轉 染 后EC-SOD、DNMT1蛋白及EC-SOD甲基化水平變化

pEGFP-N1-DNMT1組DNMT1蛋白表達（見圖5A）及EC-SOD甲基化水平（見圖5C）高于pEGFPN1組（F=7.884和6.329，P=0.028和0.037）和NC組（F=7.955和6.059，P=0.004和0.019），EC-SOD蛋白表達水平（見圖5B）低于pEGFP-N1組（F=15.365，P=0.000）和NC 組（F=6.331，P=0.037），pEGFP-N1組和NC組EC-SOD、DNMT1蛋白表達水平及ECSOD甲基化水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2　兩組主動脈病理形態(tài)變化

圖3　兩組氧化應激指標比較

圖5　pEGFP-N1-DNMT1轉染后EC-SOD、DNMT1蛋白表達及EC-SOD甲基化水平比較

3　討論

正常情況下，機體處于氧化和抗氧化動態(tài)平衡，當平衡被打破后就會導致氧自由基生成、清除失衡，引起ROS蓄積，最終引起氧化應激損傷[7-9]。目前已證實氧化應激損傷與AS的發(fā)生和進展密切相關，氧化應激能通過誘導氧化作用，引起局部炎癥反應和細胞增殖，因此針對性的抗氧化治療成為AS防治的主要手段。ApoE-/-實驗小鼠是復制AS模型常用的動物，本研究利用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，結果顯示ApoE-/-組TC、LDL、TG高于WT組，HDL低于WT組；主動脈根部切片染色顯示ApoE-/-組主動脈內(nèi)膜明顯增厚，WT組動脈組織內(nèi)皮細胞結構規(guī)則有序，證實AS小鼠模型復制成功。進一步分析兩組小鼠的氧化應激指標，結果顯示ApoE-/-組MDA、ROS呈升高趨勢，各時段ApoE-/-組MDA、ROS高于WT組，說明AS與氧化應激損傷密切相關。NOMIYA等[10]報道稱氧化應激能損傷血管內(nèi)皮細胞，進而誘發(fā)粥樣斑塊形成和脂質(zhì)沉積，這一過程亦是AS的始動因素。PEREIRA等[11]也證實高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠血脂異常升高，ROS水平增加，證實高脂血癥也會誘導氧化應激反應。

機體發(fā)生氧化應激時，能夠啟動自身的抗氧化防御體系，其中EC-SOD唯一分布于細胞外的抗氧化酶，其通過與硫酸乙酰肝素結合，將氧自由基歧化為H2O2，保護組織避免發(fā)生自由基損傷，預防AS發(fā)生[12-13]。最新研究發(fā)現(xiàn)[14]，EC-SOD還具有調(diào)節(jié)內(nèi)源性NO的作用，所產(chǎn)生的NO能夠擴張血管平滑肌、抑制血小板聚集，進而抑制AS發(fā)生和進展。本研究發(fā)現(xiàn)ApoE-/-組EC-SOD mRNA表達水平低于WT組，說明EC-SOD含量偏低引起的抗氧化防御體系功能減弱是導致AS的誘因之一。TEOH-FITZGERALD等[15]報道稱細胞外高濃度EC-SOD能夠有效清除氧自由基，減少超氧化亞硝基陰離子形成，進而保護細胞避免氧自由基損害，抑制AS的進程。BREAK等[16]也證實EC-SOD能夠抑制還原型輔酶Ⅱ（NADPH）和ROS增多而產(chǎn)生的氧自由基，將小鼠EC-SOD基因敲除后，小鼠發(fā)生AS的風險升高。

目前已經(jīng)明確EC-SOD是抗氧化的主要酶系，但是其在粥樣硬化過程中的作用機制仍存在一定爭議。隨著分子生物學的研究深入，人們逐漸認識到表觀遺傳在心血管疾病發(fā)病中的作用。作為表觀遺傳的典型標記，DNA甲基化在多種生物學功能中發(fā)揮著重要作用[17-18]。楊程等[19]對40例確診為AS的患者外周血基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1（TIMP-1）進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)AS患者外周血TIMP-1含量低于正常對照組，進一步發(fā)現(xiàn)其降低的機制與TIMP-1基因啟動子區(qū)的高甲基化密切相關，提示基因DNA甲基化也是導致AS形成的原因之一。本研究ApoE-/-組EC-SOD甲基化水平高于WT組，說明AS發(fā)病可能與EC-SOD甲基化水平增加，進而導致EC-SOD表達下調(diào)有關。DNMT1是維持基因DNA甲基化修飾狀態(tài)的主要酶系，也是調(diào)節(jié)基因DNA甲基化水平的關鍵[20]；DNMT1表達與DNA甲基化程度正相關，與基因表達負相關[21]。本研究證實ApoE-/-組DNMT1表達水平高于WT組，成功轉染DNMT1的巨噬細胞DNMT1蛋白表達及EC-SOD甲基化升高，EC-SOD蛋白表達降低，說明DNMT1催化EC-SOD轉甲基反應，導致EC-SOD水平降低，進而加重氧化應激損傷，最終形成AS。這一結果也提示DNMT1可以作為AS靶向治療的1個潛在作用靶點。

綜上所述，EC-SOD甲基化程度升高，導致ECSOD表達降低，機體抵抗氧化應激反應能力減弱，最終發(fā)展成AS。

參 考 文 獻：

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