許先凱，邱鴻杰，盧秋梅

(1．汕頭市龍湖區(qū)動(dòng)物防疫監(jiān)督所，廣東汕頭　515041；2．廣州市藥品檢驗(yàn)所，廣州　510160)

手足口病(hand- foot- mouth disease，HFMD)是一種具有較高傳染性的傳染病，由腸道病毒引起的疾病，為全球性傳染病。多發(fā)于5歲以下兒童，3歲以下的兒童發(fā)生率最高?？梢鹗?、足、口腔等部位皮膚斑丘疹、皰疹、潰瘍，個(gè)別患者可引起心肌炎、肺水腫和無(wú)菌性腦膜炎等并發(fā)癥[1]，甚至導(dǎo)致死亡。

引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種(型)，包括腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)，柯薩奇病毒A組(coxsackievirus A)4，5，9，10，16型等，其中以柯薩奇病毒A組的16型(Cox A16)和EV71型最為常見(jiàn)[2]。近年手足口病感染率呈上升趨勢(shì)，連續(xù)數(shù)年成為我國(guó)傳染病發(fā)病率最高的病種之一，對(duì)我國(guó)兒童的健康造成嚴(yán)重危害，研發(fā)出一種高靈敏度、準(zhǔn)確度、特異度的檢測(cè)方法，對(duì)手足口病防治與治療顯得尤為重要[3]。

傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)方法有病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)和常規(guī)PCR檢測(cè)，病毒分離法周期長(zhǎng)，血清學(xué)檢測(cè)法容易發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)，常規(guī)PCR檢測(cè)易發(fā)生污染等問(wèn)題，現(xiàn)已較少用于臨床。近年來(lái)，伴隨著分子技術(shù)的發(fā)展，采用熒光定量RT- PCR技術(shù)對(duì)腸道病毒進(jìn)行診斷國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確以及自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，適用于傳染性病毒的檢測(cè)[4]。由于RNA病毒基因組的高度變異率，針對(duì)CA16病毒、EV71病毒及其它腸道病毒基因組設(shè)計(jì)的引物及探針都具有一定的時(shí)效性，需要不斷更新。本實(shí)驗(yàn)對(duì)手足口病病毒檢測(cè)方法的研究，為快速檢測(cè)診斷手足口病病原體奠定基礎(chǔ)[5～7]，有利于減少該病的傳染，保護(hù)我國(guó)兒童生命健康。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象手足口病病原菌由疾病預(yù)防控制中心提取及保存；大腸埃希菌DH10由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試劑和儀器pUC19 T載體、Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Marker DL 2000，DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒(離心柱型)等均為上海生物工程有限公司產(chǎn)品。ABI 7500 熒光PCR儀為Applied Biostems公司產(chǎn)品；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)為北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1引物和探針設(shè)計(jì)：在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并選擇中國(guó)大陸近期流行EV71型，CA16型及其它腸道病毒基因序列，采用DNAstar軟件進(jìn)行序列比對(duì)，選擇腸道病毒序列的共同保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針序列，引物和探針序列如下所示：上游引物EVUN- F 5’- GACTACTTTGGGTGTCCGTG- 3’；下游引物EVUN- R 5’- GCCAATCCAATAGCTATATG- 3’；EVUN- B：MGB探針CY5 5’- GTCACCATAAGCAGCCA- 3’MGB。

1.3.2一步法RT- PCR擴(kuò)增：反應(yīng)條件：42℃30 min，95℃3 min；95℃5 s，60℃35 s，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl PCR產(chǎn)物于12 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定。

1.3.3EVUN質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的制備

1.3.3.1EVUN目的基因的純化回收：將以上PCR產(chǎn)物于12 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下切回目的片段，按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒說(shuō)明操作，回收目的DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2目的基因的克隆及鑒定：將回收的DNA片段基因克隆到pUC19克隆載體上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH10中。挑取單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，收集菌液，用高純質(zhì)粒小量制備試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及瓊脂糖凝膠鑒定，最后將陽(yáng)性質(zhì)粒送到上海英維捷基貿(mào)易有限公司測(cè)序鑒定。

1.3.3.3EVUN重組質(zhì)粒濃度的測(cè)定：利用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒的濃度，并計(jì)算其拷貝數(shù)。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的研制

1.3.4.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法反應(yīng)條件的優(yōu)化：以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，已合成的EVUN基因引物和探針，選用不同的引物探針濃度和退火溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)PCR反應(yīng)結(jié)果，選擇最佳的熒光PCR反應(yīng)條件。

引物濃度優(yōu)化：在其它條件相同情況下，比較不同引物探針濃度對(duì)熒光PCR擴(kuò)增效率影響，具體方案見(jiàn)表1。

表1 EVUN引物濃度優(yōu)化方案(μmol/L)

PCR反應(yīng)程序優(yōu)化方案：在其它條件相同情況下，設(shè)計(jì)不同(55℃，58℃，60℃，63℃，65℃)退火溫度，比較不同退火溫度對(duì)熒光PCR擴(kuò)增效率影響。

1.3.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：以8×108，8×107，8×106，8×105，8×104，8×103和8×102copies/μl 7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3重復(fù)性試驗(yàn)：選取濃度為8×102copies/μl的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)5次，根據(jù)檢測(cè)的Ct值計(jì)算變異系數(shù)，判定該檢測(cè)方法的重復(fù)性是否良好。

1.3.4.4特異性試驗(yàn)：用RNA提取試劑盒提輪狀病毒株、口蹄疫滅活毒株兩種病毒RNA，將其RNA作為特異性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.3.4.5臨床樣品：以預(yù)防控制中心的26例手足口病患者RAN為模板，和10份健康人RNA作為陰性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量RT- PCR檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPASS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算Ct值變異系數(shù)，CV≤5%為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1目的基因的克隆與鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，與pUC19克隆載體連接構(gòu)成重組質(zhì)粒，用引物對(duì)所構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，得到一條約120 bp(EVUN基因片段)DNA條帶，與連接前的PCR產(chǎn)物大小一致。將經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)定鑒定。鑒定結(jié)果與目的片段序列完全一致。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

2.2.1熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化：優(yōu)化后的熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μl，上游引物EVUN- F，下游游引物EVUN- R和探針EVUN- B終濃度分別為0.50 μmol/L，0.50 μmol/L，0.30 μmol/L，Mg離子終濃度為0.25 mmol/L，dNTP終濃度為0.30 mmol/L。

優(yōu)化后熒光定量PCR反應(yīng)條件：42℃30 min，95℃3 min；95℃5 s，58℃40 s，45個(gè)循環(huán)，在60℃接收熒光。

2.2.2按照以上最佳的優(yōu)化條件選擇：8×108，8×107，8×106，8×105，8×104，8×103，8×102copies/μl 7個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)?zāi)０澹?jiàn)圖1。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著模板濃度的減少，Ct值逐漸增大，檢測(cè)曲線線型良好，r2值達(dá)到0.99，檢測(cè)的靈敏度達(dá)到800 copies/μl。

2.2.3重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果分析：試驗(yàn)選取8×102copies/μl的標(biāo)準(zhǔn)模板以優(yōu)化的反應(yīng)條件分別連續(xù)

擴(kuò)增5次，Ct值批內(nèi)和批間變異系數(shù)(Coefficient of variation，CV)CV<5%(表2)，檢測(cè)結(jié)果表明：所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

2.2.4特異性試驗(yàn)結(jié)果：以輪狀病毒株和口蹄疫滅活毒株為對(duì)照，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明特異性良好。

圖1　EVUN基因片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)

表2 實(shí)時(shí)熒光RT- PCR的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.3臨床檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。以預(yù)防控制中心的26例手足口病患者RNA為模板，并做10份陰性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量RT- PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示：手足口病患者檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，陰性樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際診斷結(jié)果一致，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%。

表3 臨床檢測(cè)結(jié)果

3　討論

手足口病病原主要包括CA16型、EV71型及其它腸道病毒，不同腸道病毒基因之間具有一定的同源性，試驗(yàn)選取了腸道病毒基因的一段高度保守序列作為目的基因檢測(cè)片段，從而避免了漏檢問(wèn)題[5]。根據(jù)不同熒光定量PCR檢測(cè)標(biāo)記方法，分為熒光探針?lè)ê蜔晒馊玖戏ǎ瑹晒馓结樂(lè)ǔ颂禺愐锿?，還增加了特異性的熒光探針檢測(cè)，從而提高了特異性和準(zhǔn)確度，更適合臨床診斷和科學(xué)研究的需要[6～8]。MGB探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)，本身不產(chǎn)生熒光，可以大大降低本底信號(hào)的強(qiáng)度，避免干擾；同時(shí)探針上連接有MGB修飾基團(tuán)，可以將探針的Tm值提高10℃左右，因此在相同的Tm值條件下，MGB探針可以比普通TaqMan探針設(shè)計(jì)的更短，更有利于設(shè)計(jì)出保守的探針序列，從而提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度，彌補(bǔ)了檢測(cè)方法的不足[9～11]。

今年以來(lái)，全國(guó)手足口病發(fā)病率上升，部分省份呈現(xiàn)高發(fā)態(tài)勢(shì)，死亡人數(shù)上升。手足口病病原檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)，有利于手足口病患者及時(shí)檢測(cè)診斷，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，是防治手足口病的關(guān)鍵[12，13]。一步法熒光PCR檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)EV71型、CA16型和其它腸道病毒，縮短了檢測(cè)時(shí)間，節(jié)約成本，與常規(guī)的檢測(cè)方法相比，具有很大的優(yōu)勢(shì)，可適用于手足口病臨床診斷，同時(shí)也為檢測(cè)手足口病病原的研究奠定基礎(chǔ)。

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