李天瑾，楊明明，龔月生

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100)

枯草芽孢桿菌(B.subtilis)是一類耐熱抗逆性強(qiáng)，普遍存在于自然環(huán)境中的桿狀、兼性厭氧型革蘭氏陽性菌。作為一種益生菌，能夠改善動物腸道微生物環(huán)境，刺激免疫反應(yīng)，促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，淋巴細(xì)胞數(shù)增多，從而提高家畜機(jī)體免疫水平。該菌株經(jīng)由動物采食進(jìn)入胃腸道，由于胃酸、膽鹽和消化液的刺激，主要以芽孢的形式存在，并可在胃腸道中進(jìn)行萌發(fā)和繁殖?？莶菅挎邨U菌營養(yǎng)體對腸道環(huán)境敏感，容易被降解消除，而芽孢具有高穩(wěn)定性，并且基本不受腸道環(huán)境的影響，因此B.subtilis調(diào)節(jié)腸道免疫主要形式為芽孢。目前，B.subtilis芽孢和營養(yǎng)體的免疫功能已引起人們的關(guān)注。Kosaka等[1]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給小鼠飼喂B.subtilis芽孢，可顯著增加小鼠體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性，及血清中干擾素的水平。Inooka等[2]用B.subtilis飼喂雛雞時，脾臟中T,B淋巴細(xì)胞數(shù)量顯著增多。B.subtilis也可以通過誘導(dǎo)一種應(yīng)激蛋白合成，促進(jìn)腸系淋巴結(jié)的發(fā)育[3]。然而，關(guān)于芽孢調(diào)節(jié)動物腸道免疫的機(jī)制還尚不清楚。本試驗擬研究B.subtilisPY79芽孢對巨噬細(xì)胞MΦ3D4/2免疫因子分泌的影響，從而為其調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的機(jī)理提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒與引物枯草芽孢桿菌PY79(B.subtilisPY79)、枯草芽孢桿菌168(B.subtilis168)和大腸桿菌(E.coli)DH5α由本實(shí)驗室保存。本研究所有質(zhì)粒和引物分別見表1和表2。豬肺泡巨噬細(xì)胞系MΦ3D4/2由浙江大學(xué)李衛(wèi)芬教授惠贈。

表1　質(zhì)粒Table 1　Plasmids

表2　引物Table 2　Primers

1.1.2主要試劑細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(康為試劑生物科技有限公司)，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(康寧生物科學(xué)有限公司)。豬促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8)和抗炎細(xì)胞因子(IL-10)ELISA測試盒(上海邦奕生物科技有限公司)。BHI生孢培養(yǎng)基、PRMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2　試驗方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)B.subtilis細(xì)菌懸液制備：將B.subtilis在LB培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落接種于30 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。12 000 r/min離心10 min收集菌體，0.01 mol/L PBS洗滌兩次,重懸。

B.Subtilis芽孢:將B.subtilis在相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單菌落接種于30 mL相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，5 000 g離心10 min，PBS洗滌2次，30 mL PBS重懸等體積接種于BHI生孢培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)14 h。5 000 g離心10 min，收集菌體，PBS洗滌2次；加入溶菌酶37 ℃處理30 min，PBS洗滌2次；75 ℃處理30 min，PBS洗滌2次，懸浮。

1.2.2整合載體的構(gòu)建以B.subtilisPY79的基因組DNA為模板，用引物clW-up/clW-down、gerD-up/ gerD-down分別擴(kuò)增上下游同源臂clWf和gerDh；以pshuttleF質(zhì)粒為模板，用引物Specb-up/Specb-down擴(kuò)增抗性基因spec。以B.subtilisPY79的基因組DNA為模板，用引物spo0Af-up/spo0Af-down、spo0Ab-up/spo0Ab-down分別擴(kuò)增上下游同源臂spo0Af和spo0Ab。

將片段clWf、gerDh和spec克隆至pBL18相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pYGJ-6。將片段spo0Af、spo0Ab和spec克隆至pBL18相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pYGJ-8。

1.2.3突變株的構(gòu)建用EcoRI酶切整合載體pYGJ-6，使其線性化。采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化B.subtilisPY79感受態(tài)細(xì)胞，并在壯觀抗性培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子命名為B.subtilisclW-gerD-。設(shè)計引物Declw-up/Decrd-down 、Spec-up/Spec-down、 Decap-up/Decap-down和clW-up/gerD-down 檢測突變株B.subtilisclW-gerD-。

用EcoRI酶切整合載體pYGJ-8，使其線性化。用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化B.subtilisPY79感受態(tài)細(xì)胞，并在壯觀抗性培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子命名為B.subtilisspo0A-。設(shè)計引物spo0Af-up/spo0Ab-down，Spec-up/Spec-down和 Decap-up/Decap-down檢測突變株B.subtilisspo0A-。

1.2.4Bacillus.subtilis突變株的生孢和萌發(fā)檢測生長曲線檢測：B.subtilisPY79、B.subtilisclW-gerD-和B.subtilisspo0A分別在相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于30 mL相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，每隔2 h測其OD600nm值。

生孢率檢測：B.subtilisPY79、B.subtilisclW-gerD-和B.subtilisspo0A-分別在相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落分別接種于8 mL相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，每隔8 h用革蘭氏染色法檢測。

萌發(fā)率檢測：將B.subtilisPY79和B.subtilisclW-gerD-芽孢懸液按1：100接種于30 mL相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中，每隔2 h測其OD600nm值。

1.2.5B.subtilisPY79突變株對巨噬細(xì)胞(MΦ3D4/2)細(xì)胞因子分泌的影響本試驗共分為7個處理，每個處理3個重復(fù)。試驗組：細(xì)胞培養(yǎng)至單層，PBS洗滌1次，每孔加1 mL無抗PRMI-1640培養(yǎng)液，再加入1 mLB.subtilisclW-gerD-和B.subtilisspo0A-芽孢懸液。對照組：細(xì)胞培養(yǎng)至單層，PBS洗滌1次，每孔加入1 mL無抗PRMI-1640培養(yǎng)液，第一組為沒有做任何處理的MΦ3D4/2，其余四組分別加入1 mL PBS、1 mLB.subtilis168細(xì)菌懸液，1 mLB.subtilisPY79芽孢懸液和2 μL LPS(100 ng/mL)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，收集，離心(1000 g，15 min)上清液。細(xì)胞因子(IL-8、IL-1β、IL-6、IL-10)用ELISA方法檢測。

1.2.4數(shù)據(jù)處理及分析 采用SPSS 20.0進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2　結(jié)　果

2.1　突變株的構(gòu)建檢測

以B.subtilisPY79的基因組DNA做對照，用引物Declw-up/Decrd-down、Specb-up/Specb-down、Decap-up/Decap-down和clW-up/gerD-down進(jìn)行PCR檢測及酶切鑒定突變株B. subtilis clW-gerD-，結(jié)果與預(yù)期一致(圖1)。

用引物spoAf-up/spoAb-down進(jìn)行PCR檢測及酶切鑒定突變株B.subtilisspo0A-，檢測結(jié)果與預(yù)期一致(圖2)。

圖1　B.subtilis clW-gerD- PCR及酶切鑒定Fig.1　PCR identification and enzymatic digestion of B. subtilis clW-gerD-M：DNA molecular mass markers; 1,2,3,4: PCR product of clW-up/gerD-down; Lanes 8,9,10,11: PCR product ofDeclw-up/Decrd-down; 12,13,14,15: PCR product of Decap-up/Decap-down;16,17,18: PCR production ofclW-up/gerD-down digested by BamHI

圖2　B. subtilis spo0A-PCR及酶切鑒定Fig.2　PCR identification and enzymatic digestion ofB. subtilis spo0A-M：DNA molecular mass markers; Lanes 1,2,3,4: PCRproduct of spo0Af-up/spo0Ab-down; 6,7,8: PCR productionof spo0Af-up/spo0Ab-down digested by BamHI

2.2　B.subtilis突變株的生孢和萌發(fā)檢測

生長曲線檢測結(jié)果表明，突變株B.subtilisclW-gerD-的生長狀況與野生型B.subtilisPY79基本一致。突變株B.subtilisspo0A-在生長后期OD值明顯低于B.subtilisPY79(圖3)。

B.subtilisPY79、B.subtilisclW-gerD- 和B.subtilisspo0A-生孢培養(yǎng)后，革蘭染色檢測結(jié)果表明，B.subtilisPY79和B.subtilisclW-gerD-正常生孢，B.subtilisspo0A-不生孢。萌發(fā)率檢測結(jié)果表明，B.subtilisclW-gerD-芽孢完全喪失萌發(fā)能力(圖4)。

2.3　B. subtilis突變株對MΦ3D4/2細(xì)胞因子分泌的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示，B.subtilisclW-gerD-極顯著的促進(jìn)了細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)量(P<0.01)；.subtilis突變株對IL-1β、IL-8和IL-10的表達(dá)無顯著性影響。

3　討　論

芽孢是芽孢桿菌的一種特殊休眠體，具有較強(qiáng)的抗逆性。Duc[2]用鼠科的巨噬細(xì)胞與B.subtilis的芽孢做了一個體外試驗，將兩者共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞(RAW264.7)能有效地吞噬芽孢。研究表明，芽孢桿菌營養(yǎng)體、芽孢均可激活巨噬細(xì)胞，并誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌。芽孢可刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1α、TNF-α和IFN-γ[4]。堅強(qiáng)芽孢桿菌可分別在體外和體內(nèi)激活巨噬細(xì)胞。有研究報道稱，蠟樣芽胞桿菌變種的芽孢能在家禽和豬的腸道中萌發(fā)[5-6]，納豆芽孢桿菌的芽孢也能在小鼠的胃腸道中萌發(fā)[7]。因此，有必要在分子水平對B.subtilis的基因進(jìn)行改造，構(gòu)建一株芽孢不萌發(fā)突變株和不生孢突變株，進(jìn)一步研究芽孢和營養(yǎng)體對機(jī)體免疫功能的影響。本試驗選用B.subtilisPY79作為工程菌。目前，已發(fā)現(xiàn)該菌株的芽孢萌發(fā)相關(guān)基因為clW、gerD和生孢早期基因為spo0A。 將萌發(fā)基因clW、gerD分別敲除后，還保留部分萌發(fā)能力，但將clW-gerD敲除后芽孢萌發(fā)能力喪失。因此，有利于進(jìn)一步探究芽孢桿菌影響動物免疫功能的途徑和機(jī)理，明確其作用方式。

圖3　突變株生長曲線檢測Fig.3　The growth curves of mutant

圖4　萌發(fā)率檢測Fig.4　The growth curves of mutant

細(xì)胞因子可改變細(xì)胞性質(zhì)和行為，并具有免疫調(diào)節(jié)功能，是免疫應(yīng)答重要的效應(yīng)分子[8-9]。微生物

圖5　突變株對巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子表達(dá)檢測Fig.5　 Cytokine level in macrophage stimulated by mutant strains

刺激的細(xì)胞可通過釋放細(xì)胞因子激活局部免疫和系統(tǒng)免疫，因此在免疫應(yīng)答中扮演著重要的角色[10]。黃琴等[11]研究表明，B.subtilisB10芽孢可顯著提高巨噬細(xì)胞促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌，并且顯著性降低IL-10的含量。Lomakova等[12]研究結(jié)果顯示，堅強(qiáng)芽孢桿菌可誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β和IL-10。本研究結(jié)果顯示，B.subtilisclW-gerD-顯著性提高了細(xì)胞因子IL-6的分泌(P<0.01)，但對IL-1β、IL-8 和 IL-10的表達(dá)并無顯著性影響。這可能是由于菌株特異性引起的。

4　結(jié)　論

B.subtilisclW-gerD-可刺激巨噬細(xì)胞分泌促炎因子IL-6，增強(qiáng)MΦ3D4/2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體的抗感染能力。本研究為進(jìn)一步闡述芽孢桿菌對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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