李方舟，王艷華，溫　飛，杜燁青，張利坤，陳美杰，白秦生，朱海鯨，胡建宏*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.拉薩市動物疫病預(yù)防控制中心，西藏 拉薩 850000；3.陜西省秦勝牧業(yè)有限責(zé)任公司，陜西 扶風(fēng) 722206；4.榆林學(xué)院 陜北白絨山羊工程技術(shù)研究中心，陜西 榆林 719000)

國內(nèi)外對羊肉與羊絨等產(chǎn)品的需求與日俱增，提高養(yǎng)羊業(yè)的生產(chǎn)效率，實現(xiàn)山羊品種的擴(kuò)繁迫在眉睫，而精液保存技術(shù)正是加強(qiáng)山羊良種擴(kuò)繁的關(guān)鍵。山羊冷凍精液保存技術(shù)作為精液保存技術(shù)的一種，能實現(xiàn)精液遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，延長精子使用時間，提高種公羊的利用率，降低生產(chǎn)成本，有效推進(jìn)山羊品種改良工作。精液冷凍過程中溫度的變化會對精子造成冷凍損傷，嚴(yán)重影響精子質(zhì)量。大量研究表明，在精液冷凍稀釋液中加入保護(hù)劑可提高冷凍保存后精子質(zhì)量[1-4]。近年來，多糖作為冷凍保護(hù)劑開始受到研究者的關(guān)注[5-7]。海帶多糖(LJP)是從海帶中提取出來的一種物質(zhì)，具有抗氧化、降低血壓、降低血脂、抑制腫瘤生長等功能。陳西英[8]在綿羊冷凍稀釋液中加入了海帶多糖，結(jié)果表明海帶多糖可以有效提高綿羊凍精保存的精子活率，其中最適濃度為1.0 mg/mL。Hu等[3]發(fā)現(xiàn)海帶多糖不僅能夠有效改善凍融后的豬精子活率，同時也顯著增加了精漿中三種抗氧化酶(SOD、 CAT、GSH-Px)的活性。枸杞多糖(LBP)是傳統(tǒng)中藥的提取物，也具有抗氧化、降血脂、降血壓、抗腫瘤等多種生物活性。何濤[9]在豬精液冷凍稀釋液中加入枸杞多糖，結(jié)果表明添加濃度為0.75 mg/mL的枸杞多糖后，精液品質(zhì)得到了顯著提高。

本試驗在山羊冷凍精液稀釋液中分別加入不同濃度海帶多糖和枸杞多糖，研究兩種物質(zhì)對精子活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率、線粒體活性的影響，另外聯(lián)合添加海帶多糖與枸杞多糖，探討兩者有無協(xié)同作用，以便進(jìn)一步提高山羊冷凍精液的品質(zhì)。

1　材料與方法

1.1　主要試劑與儀器

檸檬酸、果糖、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸鈉、羅丹明123(R-8004，Sigma)、二甲基亞砜(Amresco 0231)、異硫氰酸酯熒光素標(biāo)記的花生凝集素、碘化丙啶(P4170，Sigma)、硫酸鏈霉素(華北制藥股份有限公司)、霉素鈉、海帶多糖與枸杞多糖均由Solarbio公司提供。 倒置熒光顯微鏡(NIKON，日本)、程序降溫儀(Cryologic，澳大利亞)、高速臺式離心機(jī)、電子恒溫水浴鍋、電子分析天平、壓力蒸汽滅菌器、恒溫干燥箱、移液槍(Eppendorf，德國)。

1.2　試驗設(shè)計

分別添加不同濃度的海帶多糖與枸杞多糖于冷凍基礎(chǔ)稀釋液中，凍融后檢測精子品質(zhì)，找到最適宜的添加濃度；根據(jù)前兩個試驗的最適宜添加濃度，聯(lián)合添加海帶多糖、枸杞多糖(表1)，最后檢測山羊精液冷凍保存的效果。其中每個處理組重復(fù)數(shù)為3個。

1.3　冷凍稀釋液配制

基礎(chǔ)稀釋液：檸檬酸1.825 g ，Tris 3.634 g，果糖0.504 g，加到100 mL超純水中，混勻，于4 ℃保存?？寡趸瘎┨砑樱悍謩e將不同濃度的海帶多糖、枸杞多糖、海帶多糖與枸杞多糖的配伍添加到基礎(chǔ)稀釋液中(表1)。冷凍稀釋I液：向基礎(chǔ)稀釋液中添加0.4 g/mL鏈霉素和2 000 IU/mL青霉素，然后加入達(dá)到稀釋液總量15%的卵黃。冷凍稀釋II液：在稀釋I液中直接加入5%的甘油。

表1　山羊精液冷凍稀釋液中不同抗氧化劑濃度Table 1　The concentration of different antioxidant in cryopreservation extenders of goat sperm

1.4　其它溶液配制

低滲液：稱取果糖0.9 g和檸檬酸鈉0.49 g，溶于100 mL雙蒸水中。FITC-PNA染液：取PBS溶液100 mL，加入FITC-PNA 0.000 1 g，溶解；過濾(0.45 μm濾膜)；-20 ℃保存。碘化丙啶(PI)貯存液配制：取PBS溶液10 mL，加入PI 0.000 2 g，溶解；過濾(0.45 μm濾膜)，-20 ℃保存。羅丹明 123(Rh123)貯存液配制：取0.000 2 g羅丹明123，加入 到1 mL二甲基亞砜 (DMSO)溶液中，溶解，過濾(0.45 μm濾膜)，常溫保存。

1.5　精液處理

1.5.1精液的采集與處理試驗所用精液來源于5只年齡3～4歲的陜北白絨山羊。用假陰道法采集精液，將精子活力為0.8以上的精液保存于38～40 ℃保溫杯中，1 h內(nèi)帶回實驗室。

1.5.2精液的第一次稀釋與平衡按照精液、稀釋液1：2的比例，用冷凍稀釋I液稀釋精液，16層紗布包嚴(yán)，4 ℃ 溫度下降溫平衡2 h。

1.5.3精液的第二次稀釋與平衡將第一次稀釋平衡后的精液與冷凍稀釋II液，按照1:2比例再次稀釋，16層紗布包裹后置于4 ℃溫度下平衡1.5 h。

1.5.4精液的冷凍與解凍4 ℃下將精液分裝于0.25 mL細(xì)管，放入程序冷凍儀，速率調(diào)至1 ℃/min ，降溫為5 ℃～-5 ℃。當(dāng)恒溫至-5 ℃時，將細(xì)管取出放于液氮上方3～5 cm處5 ～7 min，然后再迅速投入液氮中冷凍。兩周后取出，在38 ℃溫度下解凍30 s。

1.6　檢測指標(biāo)

1.6.1精子活率精液解凍后，取樣10 μL，制片后置于配備37 ℃ 恒溫臺的光學(xué)顯微鏡(400×)下觀察，按照估測法進(jìn)行精子活率判定。每個樣本觀察三個視野。

1.6.2精子頂體完整率移液槍吸取精液30 μL于載玻片上制片，自然干燥后，用甲醇固定10～15 min，然后用10 μL FITC-PNA 染色，37 ℃避光潮濕環(huán)境保存，30 min后用PBS沖洗，待自然干燥后封片，放置在熒光顯微鏡下觀察。異硫氰酸酯熒光素標(biāo)記的花生凝集素(FITC-PNA)染色的方法[11]檢測頂體完整率。

1.6.3精子質(zhì)膜完整率吸取20 μL精液，與等溫低滲溶液(HOST)200 μL混勻，置于37 ℃環(huán)境1 h，在400×顯微鏡下觀察，觀察精子彎尾率。采用低滲腫脹(HOST)[12]試驗方法測定精子質(zhì)膜完整率。

1.6.4精子線粒體活性先將精液用精液稀釋I液稀釋，然后吸取50 μL，再加入PI和Rh123混合液(PI貯存液1 μL+Rh123貯存液1 μL，避光放置10 min后形成)，混勻，放置30 min，最后每組取10 μL樣品滴于載玻片上，顯微鏡下(400×)觀察，計算線粒體活性。

1.7　統(tǒng)計分析

用 Excel 2013對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SPSS 22.0對結(jié)果進(jìn)行方差分析，用Duncan法進(jìn)行均值的多重比較，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2　結(jié)果與分析

2.1　海帶多糖對山羊精液冷凍保存效果的影響

由表2可知，相較于對照組，在冷凍基礎(chǔ)稀釋液中添加不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL)的海帶多糖均能提高解凍后精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率及線粒體活性。當(dāng)添加濃度為1.0 mg/mL海帶多糖時效果最佳，其精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率及線粒體活性均顯著高于其余各組(P<0.05)。此外，添加濃度為4.0 mg/mL海帶多糖時效果相對較差，其精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率及線粒體活性和對照組相似(P>0.05)。

表2　海帶多糖對山羊精液冷凍效果的影響Table 2　Effect of Laminaria Japonica Polysaccharide on cryopreserved goat semen

注：同列數(shù)據(jù)上標(biāo)小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05)，相同表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note：Values with different lowercase superscripts in the same column mean significant difference (P<0.05),same letters mean insignificant difference (P>0.05). The same below.

2.2　枸杞多糖對山羊精液冷凍保存效果的影響

由表3可知，在基礎(chǔ)稀釋液中加入不同濃度的枸杞多糖均能提高山羊精液質(zhì)量(精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率及線粒體活性)。其中，添加濃度為4.0 mg/mL和6.0 mg/mL的枸杞多糖能顯著提高山羊精子冷凍保存效果(P<0.05)，以添加濃度為4.0 mg/mL的枸杞多糖效果最佳。當(dāng)添加高濃度的枸杞多糖(8.0 mg/mL)時，除精子活率外，精子的頂體完整率、質(zhì)膜完整率及線粒體活性均與對照組差異不顯著(P>0.05)。

表3　枸杞多糖對山羊精液冷凍效果的影響Table 3　Effect of Lycium Barbarum Polysaccharide on cryopreserved goat semen

2.3　聯(lián)合添加海帶多糖和枸杞多糖對山羊精液冷凍保存效果的影響

由表4可知，與對照組相比，聯(lián)合添加海帶多糖與枸杞多糖濃度為0.5 mg/mL+4.0 mg/mL時對于精子活率與頂體完整率的改善效果最好(P<0.05)；與對照組相比，聯(lián)合添加海帶多糖+枸杞多糖為1.0 mg/mL+2.0 mg/mL時對于精子質(zhì)膜完整率的改善效果最好(P<0.05)；聯(lián)合添加海帶多糖+枸杞多糖濃度分別為0.5 mg/mL+4.0 mg/mL和1.0 mg/mL+2.0 mg/mL的結(jié)果與單獨添加海帶多糖最適濃度組和單獨添加枸杞多糖最適濃度組的精液質(zhì)量(精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率以及線粒體活性)差異均不顯著(P>0.05)；所有聯(lián)合添加組與單獨添加組之間以及各自組間的精子線粒體活性均無顯著性差異(P>0.05)。

表4　聯(lián)合添加海帶多糖和枸杞多糖對山羊精液冷凍效果的影響Table 4　Combined effect of Laminaria Japonica Polysaccharide and Lycium Barbarum Polysaccharide

3　討　論

在精液冷凍保存過程中，溫度的變化是造成精子損傷的主要因素，因此需要加入冷凍保護(hù)劑以提高精液凍存后的品質(zhì)。本試驗將海帶多糖作為非滲透性冷凍保護(hù)劑以研究其對精液品質(zhì)影響，結(jié)果表明，一定濃度海帶多糖可提高山羊精液冷凍保存質(zhì)量，以添加濃度為1.0 mg/mL的海帶多糖效果最佳。何濤等[12]發(fā)現(xiàn)在豬精液冷凍稀釋液中添加濃度為1.0～1.5 mg/mL海帶多糖可提高豬精液冷凍質(zhì)量。陳西英[8]發(fā)現(xiàn)，稀釋液中添加1.0 mg/mL的海帶多糖能夠提高抗氧化酶SOD活性，抑制ROS的發(fā)生，綿羊凍融后的精子質(zhì)量。上述研究與本試驗結(jié)果基本一致，這可能跟海帶多糖的物理和化學(xué)特質(zhì)相關(guān)。海帶多糖由于分子量過大，不能穿過細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓不同，會使精子適度脫水。另外海帶多糖一定的黏稠性，可包圍于精子周圍而使精子內(nèi)冰晶數(shù)量減少，達(dá)到保護(hù)精子提高精液品質(zhì)的效果[13]。

本試驗中，添加4.0 mg/mL枸杞多糖可以顯著提高山羊精液凍融后的品質(zhì)，其凍融后的精子活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體活性等各項指標(biāo)較對照組均有明顯提高。黃宗軒等[14]發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能提高精子質(zhì)量和數(shù)量；劉心昕等[15]發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能改善患有少精癥的大鼠的精子再生能力。何濤等[12]在豬的精液冷凍稀釋液中添加枸杞多糖，發(fā)現(xiàn)添加濃度為0.75 mg/mL效果最佳。枸杞多糖對凍精的保護(hù)機(jī)制，可能與海帶多糖類似：一是枸杞多糖所含的多種糖類可清除羥自由基，從而減少MDA產(chǎn)生的可能以及細(xì)胞膜流動性的下降[16]；二是可能與海帶多糖一樣，通過造成細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差異而使精子細(xì)胞脫水，減少胞內(nèi)冰晶的形成，從而起到保護(hù)精子的作用[17-19]；三是類似于海帶多糖的物理黏性，使精子細(xì)胞外圍形成小環(huán)境，減少因冰晶形成而造成的精子細(xì)胞損傷。Fuller等[20]認(rèn)為精子結(jié)構(gòu)完整程度跟精子質(zhì)膜的完整性相關(guān)性很高。一般情況下，在冷凍精液冷凍降溫過程中，精子內(nèi)外滲透壓的壓差，會使精子發(fā)生脫水收縮現(xiàn)象，導(dǎo)致精子質(zhì)量下降。而枸杞多糖因含糖羥基能夠一定程度避免高滲環(huán)境的出現(xiàn)，從而維持精子細(xì)胞膜的穩(wěn)定[21]。本試驗中，6.0 mg/mL組和8.0 mg/mL組雖也能一定程度上提高精液冷凍保存效果，但以4.0 mg/mL添加量效果最好，筆者分析可能是過于黏稠的枸杞多糖能夠阻礙精子細(xì)胞代謝所致。

本試驗發(fā)現(xiàn)，精液冷凍保存過程中，適量添加海帶多糖或者枸杞多糖都能提高精液冷凍保存品質(zhì)，這表明海帶多糖和枸杞多糖均可對凍精起到保護(hù)作用。有不少研究表明，多種類型糖的配合使用對精液冷凍的效果比單一類型的糖效果好[22-23]。潘紅梅等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在豬精子冷凍保存中，乳糖、蔗糖和海藻糖等不同類型雙糖的組合的精子質(zhì)量保存效果優(yōu)于單一類型的糖。本試驗也表明，在山羊精液冷凍保存過程中，添加海帶多糖和枸杞多糖的雙糖組合的冷凍保存效果同樣優(yōu)于單獨添加海帶多糖或枸杞多糖，這與前人的研究結(jié)果基本一致。其中聯(lián)合添加海帶多糖和枸杞多糖濃度為1.0 mg/mL+2.0 mg/mL以及0.5 mg/mL+4.0 mg/mL時效果更佳，這也暗示海帶多糖與枸杞多糖兩種多糖在精子冷凍保存即減少精子冷凍氧化損傷方面可能存在一定協(xié)同效應(yīng)。而濃度為1.0mg/mL+4.0 mg/mL的海帶多糖與枸杞多糖的組合時，保存效果與單獨添加時無顯著差異，這可能由于高濃度的多糖物理黏性過強(qiáng)，阻礙了精子活動及細(xì)胞代謝所致。

4　結(jié)　論

本研究結(jié)果表明，山羊精液冷凍保存時，在稀釋液中添加一定量的海帶多糖或者枸杞多糖均能有效提高山羊精液的冷凍保存質(zhì)量，其中1.0 mg/mL和4.0 mg/mL為其最適添加濃度；聯(lián)合添加海帶多糖與枸杞多糖，山羊精液冷凍保存效果更佳，其較佳濃度組合為1.0 mg/mL+2.0 mg/mL組合和0.5 mg/mL+4.0 mg/mL組合。

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