劉尊, 汪勇, MARTIN J T REANEY, FIORENTY OCTAVIA SUGIWAN,NANDA AYU YULISTYANITA，張寧*

1(廣東高校油脂生物煉制工程技術(shù)研究中心，暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)2(暨南大學(xué) 薩斯喀切溫大學(xué) “油料生物煉制與營養(yǎng)”聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510632)3(加拿大薩斯喀切溫大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物資源學(xué)院，加拿大 薩斯卡，S7N5A8)

亞麻又稱胡麻，屬一年生或多年生草本植物，為我國重要油料經(jīng)濟(jì)作物。亞麻籽中含有多種生理活性物質(zhì)，除了亞麻籽膠和木酚素外，還有一類疏水性環(huán)形多肽[1-4]。亞麻籽環(huán)肽(flaxseed cyclolinopeptide, FCLPs)主要由異亮氨基酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸組成[5]。已從植物、真菌、細(xì)菌以及海洋生物中分離得到具有生物活性的環(huán)肽[6-8]。相比普通直鏈小分子肽，環(huán)肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)更具穩(wěn)定性，高效的抗菌活性以及抗腫瘤、消炎等生理活性[9-12]。亞麻籽環(huán)肽A展現(xiàn)了一定的免疫抑制活性[13]，亞麻籽環(huán)肽B和環(huán)肽E也被報(bào)道對細(xì)胞分裂素具有抑制作用[14-15]。但亞麻籽環(huán)肽對霉菌的抑制作用及機(jī)理尚未有報(bào)道。

據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization, FAO)統(tǒng)計(jì)，全球約有25%的糧作物受真菌毒素的污染[16-17]。岳淑麗等[18]研究了桉葉精油對酵母菌、細(xì)菌和霉菌的抑菌性能，桉葉精油具有良好的抑菌效果，且抑菌性與傘花烯、檸檬烯和桉葉素等抑菌成分有關(guān)。HOU等[19]研究了甘氨酸基本多肽在新鮮濕面的應(yīng)用和抗真菌特性，結(jié)果表明隨著甘氨酸基本多肽濃度的提高，對黑曲霉和青霉菌的菌絲生長和孢子萌芽的抑制效果越好。

本文主要通過對宛氏擬青霉和黃曲霉的菌落生長、孢子形成和孢子萌發(fā)的抑制作用來評價(jià)FCLPs的抗霉菌活性；FCLPs進(jìn)行經(jīng)高溫滅菌和未加熱滅菌不同處理，探究環(huán)肽的熱穩(wěn)定性；并初步分析了霉菌培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中FCLPs的變化。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

1.1.1試驗(yàn)材料

亞麻籽環(huán)肽標(biāo)準(zhǔn)品(環(huán)肽A、環(huán)肽C、環(huán)肽E、環(huán)肽D)、亞麻籽環(huán)肽混合物(純度>60%，其余成分主要為脂肪酸)，Prairie Tide Chemical Inc.；無水乙醇(分析純)，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；甲醇(色譜純)，MREDA TECHNOLOGY INC.。

1.1.2培養(yǎng)基及試驗(yàn)菌株

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA), 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

試驗(yàn)菌株：宛氏擬青霉(AS 3.776),廣東省微生物菌種保藏中心；黃曲霉(CICC 2476),中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2　儀器與設(shè)備

THZ-98A 型恒溫振蕩箱，上海一恒科技有限公司；HPS-280型生化培養(yǎng)箱，廣州萬寶特種制冷設(shè)備有限公司；高溫滅菌鍋，廣州合眾生物科技有限公司；超凈臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；HC-2518高速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司；DZF-6020真空干燥機(jī)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；LC-20AD 高效液相色譜儀，日本島津公司； Diamonsil C18分析柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)，迪馬公司。

1.3　方法

1.3.1亞麻籽環(huán)肽混合物溶液制備

稱取亞麻籽環(huán)肽混合物粉末溶解于95%的乙醇中，制備得到質(zhì)量濃度為100 mg/mL的溶液。

1.3.2霉菌孢子懸浮液的配制

將試驗(yàn)菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d。量取10 mL無菌水于試管中，然后用無菌接種環(huán)輕輕刮下表面孢子，用無菌水稀釋，充分振蕩搖勻，顯微鏡計(jì)數(shù)，使菌懸浮液濃度達(dá)106CFU/mL。

1.3.3亞麻籽環(huán)肽混合物抑制菌落生長活性測定

分別于121 ℃高溫15 min滅菌前、后向PDA平板中添加亞麻籽環(huán)肽混合物溶液，使質(zhì)量濃度梯度為2.4、1.2、0.6、0.3、0.15、0.075 mg/mL。對照組則添加等量等濃度乙醇溶液。用移液槍精確吸取5 μL試驗(yàn)菌種孢子懸浮液在培養(yǎng)基平板上每120°點(diǎn)種，每組重復(fù)3次。待菌液風(fēng)干后，于25 ℃的恒溫倒置培養(yǎng)， 48 h或72 h十字交叉法測量菌落直徑，取平均值，計(jì)算抑制菌落生長活性：

(1)

式中：I為抑制菌落生長活性；d1為對照組菌落直徑；d2為亞麻籽環(huán)肽組菌落直徑。

1.3.4亞麻籽環(huán)肽混合物抑制霉菌孢子形成測定

取1.3.3 培養(yǎng)了72 h后的菌落平板，加入10 mL無菌水，用涂布棒將平板上孢子輕刮下來制成孢子懸浮液，孢子懸浮液經(jīng)過梯度稀釋，采用傾注法平板計(jì)數(shù)，按公式(2)計(jì)算孢子形成抑制率，用EXCEL統(tǒng)計(jì)軟件求出亞麻籽環(huán)肽混合物對孢子形成的IC50值。

(2)

式中：I′為孢子形成抑制率；C1為對照組孢子數(shù)；C2為亞麻籽環(huán)肽組孢子數(shù)。

1.3.5亞麻籽環(huán)肽混合物抑制霉菌孢子萌芽率

取50 mL的三角瓶加入20 mL的察氏液體培養(yǎng)基，加入適量的亞麻籽環(huán)肽混合物溶液配制最終質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL。隨后移取適量孢子懸浮液至察氏液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃下振蕩恒溫培養(yǎng)48 h。取1滴培養(yǎng)液于載玻片上后在高倍鏡下觀察孢子發(fā)芽情況，取平均值。乙醇作為對照。按公式(3)計(jì)算亞麻籽環(huán)肽混合物對孢子萌發(fā)的抑制率。

(3)

1.3.6霉菌PDA中環(huán)肽的提取

從抑菌試驗(yàn)PDA平板培養(yǎng)物中提取亞麻籽環(huán)肽，對比亞麻籽環(huán)肽在培養(yǎng)霉菌前后的變化。培養(yǎng)霉菌的PDA平板取0.3 g培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，加入1.4 mL 100%無水乙醇溶液振蕩破碎獲均勻懸浮液。懸浮液以4 000 r/min，離心10 min，取上清液在真空干燥箱中放置6 h除去乙醇。干燥后樣品溶于1 mL色譜純甲醇，0.45 μL過濾膜過濾后作為高效液相色譜分析樣品待用。

1.3.7高效液相色譜分析亞麻籽環(huán)肽組分

使用 Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)； 流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為蒸餾水，柱溫為35 ℃，紫外檢測波長為214 nm，進(jìn)樣體積為10 μL，采用梯度洗脫，外標(biāo)法定量。HPLC梯度洗脫程序如下[20]： 0 min，50%A-50%B；0～6 min，50%A-50%B；6～7 min，65%A+35%B；7～19 min，65%A+35%B；19～22 min，66%A+34%B；22～23 min，70%A+30%B；23～24 min，100%A； 24～31 min，50%A-50%B；31～41 min，50%A+50%B。0～23min內(nèi)，流速均為0.5 mL/min，24～41 min內(nèi)的流速均為1 mL/min。

2　結(jié)果與分析

2.1　亞麻籽環(huán)肽混合物對宛氏擬青霉的抑制作用

表1和表2分別為不同質(zhì)量濃度的FCLPs對宛氏擬青霉的菌落生長和孢子形成的抑制結(jié)果。

由表1可知，隨著FCLPs的增加，宛氏擬青霉菌落生長和孢子的抑制效果增強(qiáng)，未高溫滅菌的FCLPs在質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí)，對菌落生長抑制率I(48.5%)和孢子形成抑制率I′(77.3%)均達(dá)最大抑制活性。72 h的抑制率I( 36.0%)相比48 h (48.5%)略有下降，表明培養(yǎng)時(shí)間的延長會(huì)減弱抑菌效果。FCLPs對宛氏擬青霉孢子形成的抑制率高于對菌落生長的抑制率，推測FCLPs可能抑制了菌絲的分化。經(jīng)高溫滅菌和未高溫滅菌的FCLPs對宛氏擬青霉孢子形成的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為0.53 mg/mL和0.34 mg/mL。相同質(zhì)量濃度下，高溫滅菌后FCLPs對宛氏擬青霉的抑制率I和I′的抑制活性最多分別降低23.2%(0.15 mg/mL)和23.3%(0.6 mg/mL)，說明高溫處理(121 ℃, 15 min)后的FCLPs仍可保持76.5%左右的抑菌活性。

表1　不同質(zhì)量濃度的亞麻籽環(huán)肽混合物對宛氏擬青霉菌落生長的抑制效果Table 1　Inhibition of FCLPs on the radial growth ofPaecilomyces varioti Bainier

表2　不同質(zhì)量濃度的亞麻籽環(huán)肽混合物對宛氏擬青霉孢子形成的抑制效果Table 2　Inhibition of FCLPs on spores formation ofPaecilomyces varioti Bainier

2.2　亞麻籽環(huán)肽混合物對黃曲霉的抑制作用

亞麻籽環(huán)肽混合物對黃曲霉菌落生長和孢子形成的抑制作用見表3和4。未高溫滅菌的FCLPs對黃曲霉的抑制率I和I′都在2.4 mg/mL時(shí)最高，分別為32.9%和86.8%。48 h時(shí)抑制活性I(32.9%)高于72h (26.9%)，同宛氏擬青霉實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。經(jīng)高溫滅菌和未高溫滅菌的FCLPs對黃曲霉孢子形成的IC50值分別為0.31和0.24 mg/mL。與宛氏擬青霉的抑菌效果相比，F(xiàn)CLPs對黃曲霉的抑制率I遠(yuǎn)低于宛氏擬青霉，但是抑制率I′略高于宛氏擬青霉。可以推測，F(xiàn)CLPs對宛氏擬青霉和黃曲霉的抑制機(jī)理，可能不是抑制營養(yǎng)菌絲體的生長，而是通過抑制氣生菌絲體的孢子分化，從而可以解釋FCLPs對2株霉菌的孢子生長抑制率要高于對菌落生長的抑制率。高溫滅菌處理使FCLPs的抑制活性部分喪失，最低可保持 41.7%(抑制孢子形成)的活性。

表3　不同質(zhì)量濃度的亞麻籽環(huán)肽混合物對黃曲霉菌落生長的抑制效果Table 3　Inhibition of FCLPs on the radial growth ofAspergillus flavus

表4　不同質(zhì)量濃度的亞麻籽環(huán)肽混合物對黃曲霉孢子形成的抑制效果Table 4　Inhibition of FCLPs mixtures on spores formationof Aspergillus flavus

2.3　亞麻籽環(huán)肽混合物對霉菌孢子萌芽的抑制作用

未高溫滅菌的FCLPs(0.6 mg/mL)，對宛氏擬青霉和黃曲霉的孢子萌芽的抑制作用結(jié)果見表5。相比對照組，F(xiàn)CLPs對宛氏擬青霉和黃曲霉都表現(xiàn)了對霉菌孢子萌芽的抑制效果，平均抑制率分別為8.22%和18.5%，黃曲霉組的孢子萌芽率要明顯高于宛氏擬青霉，說明FCLPs對宛氏擬青霉孢子發(fā)芽的抑制作用要強(qiáng)于對黃曲霉孢子。

2.4　霉菌培養(yǎng)基中殘留環(huán)肽的分析

圖1為從培養(yǎng)宛氏擬青霉的PDA培養(yǎng)基中提取的FCLPs，圖2是從黃曲霉的PDA培養(yǎng)基中提取的FCLPs。參照左洋等[21-22]所做的標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC結(jié)果，環(huán)肽C信號(hào)峰的保留時(shí)間為15 min左右，隨后出峰的是環(huán)肽E(19 min左右)、環(huán)肽D(20 min左右)、環(huán)肽A(27 min左右)，其保留時(shí)間及出峰順序與標(biāo)準(zhǔn)樣品是基本一致的，結(jié)果表明經(jīng)過霉菌培養(yǎng)后，F(xiàn)CLPs的已知的4種環(huán)肽的比例沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化，也沒有發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中環(huán)肽霉菌代謝物的產(chǎn)生。但是對比高溫滅菌和未經(jīng)高溫滅菌的FCLPs，可以看到熱處理過后的FCLPs中的4種環(huán)肽的峰面積較未經(jīng)熱處理的有所降低，這表明高溫?zé)崽幚斫档土谁h(huán)肽C、E、D和A的含量，這可能影響了FCLPs的抑菌活性，這與前面發(fā)現(xiàn)的高溫處理導(dǎo)致FCLPs的抑菌活性下降的結(jié)果是一致。

表5　亞麻籽環(huán)肽混合物對霉菌孢子萌芽的抑制作用Table 5　Inhibition of FCLPs against fungal spore germination

圖1　1.2 mg/mL宛氏擬青霉PDA提取亞麻籽環(huán)肽(未高溫滅菌和高溫滅菌)的HPLC譜圖Fig.1　HPLC of 1.2 mg/mL FCLPs (not autoclaved andautoclaved) extracted from Paecilomyces variotibainier PDA

圖2　2.4 mg/mL黃曲霉PDA提取亞麻籽環(huán)肽(未高溫滅菌和高溫滅菌)HPLC譜圖Fig.2　HPLC of 2.4 mg/mL FCLPs (not autoclaved andautoclaved) extracted from Aspergillus flavus PDA

3　結(jié)論

本文選取宛氏擬青霉和黃曲霉2株霉菌作為試驗(yàn)菌株，通過菌落生長直徑、孢子計(jì)數(shù)和孢子萌芽率評價(jià)121 ℃高溫滅菌前后不同濃度的FCLPs對霉菌的抑制活性。結(jié)果表明，F(xiàn)CLPs的抑菌活性隨濃度升高而增強(qiáng)，對宛氏擬青霉的抑制活性最高達(dá)48.5% (菌落生長)和77.3% (孢子形成)；對于黃曲霉，抑制活性最高分別為32.9% (菌落生長)和86.8% (孢子形成)。FCLPs對宛氏擬青霉孢子的IC50值分別為0.53 mg/mL(經(jīng)高溫滅菌)和0.34 mg/mL(未高溫滅菌)；對黃曲霉孢子的IC50值則分別為0.31 mg/mL(經(jīng)高溫滅菌)和0.24 mg/mL(未高溫滅菌)。高溫滅菌后FCLPs保持了部分抑菌活性。通過孢子萌芽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CLPs對2株霉菌的孢子萌芽都有明顯的抑制效果，且對宛氏擬青霉孢子萌芽的抑制率高于對黃曲霉孢子的抑制率。通過高效液相色譜對霉菌PDA培養(yǎng)基中提取的FCLPs的分析，發(fā)現(xiàn)對比已知的亞麻籽環(huán)肽標(biāo)準(zhǔn)樣品圖譜，環(huán)肽A、C、D和E在霉菌培養(yǎng)前后沒有產(chǎn)生新的環(huán)肽代謝物，但是高溫?zé)崽幚頃?huì)降低環(huán)肽的含量，從而導(dǎo)致抑菌活性有所減弱。綜上所述，F(xiàn)CLPs具有抑制宛氏擬青霉和黃曲霉孢子形成、萌發(fā)和菌絲生長活性，高溫滅菌后還能保持部分活性，表明其具有良好的熱加工適應(yīng)性，有潛力成為新型天然防腐劑。

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