鄭肖蘭， 趙　爽，2， 韓小雯，2， 習(xí)金根， 鄭金龍， 梁艷瓊， 吳偉懷， 李　銳， 賀春萍， 易克賢，3

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南?？?571101； 2.海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南?？?570228；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南?？?571101)

鏈格孢屬(Alternariasp.)是一類極為常見的真菌，廣泛分布在農(nóng)作物、樹木、空氣、土壤、污水等多種基質(zhì)中，是重要的植物病原菌。在美國農(nóng)業(yè)部真菌寄主索引中記錄了4 000多種鏈格孢屬真菌，是農(nóng)作物的主要致病菌之一，它能引起包括玉米、小麥、煙草、馬鈴薯、番茄、蘋果、梨等幾十種農(nóng)作物發(fā)病，如發(fā)生黑斑病、褐斑病、葉斑病、赤星病等，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量，給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大損失[1]。

玉米作為主要的糧食作物，優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)玉米和制種玉米不斷被推廣[2]，在生產(chǎn)上玉米葉斑病的危害日趨嚴(yán)重，在我國云南、遼寧、黑龍江、甘肅和吉林等省部分玉米種植區(qū)均有發(fā)生，該病主要危害玉米葉片和苞葉，病斑不規(guī)則、透光、中央灰白色、邊緣褐色。玉米生長季節(jié)發(fā)生的葉斑病主要有大斑病、小斑病和褐斑病，部分地區(qū)可能發(fā)生灰斑病以及彎孢屬(Curvalaria)、鏈格孢屬(Alternariasp.)病原菌引起的葉斑病[3]。幾種病害的發(fā)生規(guī)律大體相似，病原菌都以病殘體越冬，借風(fēng)雨傳播，病害一般從下部葉片開始發(fā)生，高溫高濕天氣有利于病害流行[4]，由于氣候原因，病原菌對宿主侵染危害會因宿主、環(huán)境等差異表現(xiàn)出不同的病害形態(tài)[5]，從外觀上比較難以辨別[6]。因此，本研究對海南省南繁區(qū)玉米葉斑病病菌進(jìn)行分離鑒定，并研究其生物學(xué)特性。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

1.1.1供試材料供試材料為于海南省三亞市田獨鎮(zhèn)南濱農(nóng)場玉米南繁基地采集到的病葉。

1.1.2供試培養(yǎng)基(1)PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g煮出液、葡萄糖18.0 g、瓊脂20.0 g，加水至 1 000 mL。(2)PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g煮出液、蔗糖20.0 g、瓊脂20.0 g，加水至 1 000 mL。(3)玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基：玉米綠葉100.0 g煮出液、20.0 g瓊脂、4.0 g CaCO3，加水至1 000 mL。(4)PDA+玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基：PDA和玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基等量混合。(5)PSA+玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基：PSA和玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基等量混合。(6)燕麥培養(yǎng)基：30.0 g燕麥煮出液、15.0 g蔗糖、20.0 g瓊脂，加水至 1 000 mL。(7)Czapek培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.50 g、K2HPO41.00 g、KCl 0.50 g、NaNO32.00 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蔗糖20.00 g、瓊脂20.00 g，加水至 1 000 mL。上述培養(yǎng)基均于121 ℃高壓滅菌20 min后備用。如果需要加入抗生素，則待培養(yǎng)基冷卻至40～60 ℃，加入50.0 μg/mL四環(huán)素、100.0 μg/mL 鏈霉素，搖勻倒平板備用。

1.1.3試劑瓊脂、葡萄糖、蔗糖、CaCO3、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KCl、NaNO3、FeSO4·7H2O、淀粉、鏈霉素、四環(huán)素、HCl、NaOH、麥芽糖、乳糖、D-木糖、D-果糖、L-精氨酸、L-絲氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酰胺、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸、蘇氨酸、甘氨酸等。

1.1.4儀器設(shè)備打孔器、培養(yǎng)皿、錐形瓶、超凈工作臺、電子天平、搖床、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌鍋、電子顯微鏡、水浴鍋、酒精燈、剪刀、鑷子等。

1.2　試驗方法

1.2.1病原菌的分離與鑒定

1.2.1.1病原菌的分離與純化從海南省三亞市田獨鎮(zhèn)南濱農(nóng)場玉米南繁基地采集癥狀典型的玉米葉斑病病葉，采用常規(guī)組織分離和單孢分離法進(jìn)行分離純化，獲得的菌株(命名為C22菌株)置于斜面培養(yǎng)基低溫(4 ℃)保存。

1.2.1.2柯赫氏法則驗證參照柯赫氏法則，將培養(yǎng)好的菌落，接種至新鮮健康的玉米葉片上，玉米葉片接菌后，底部鋪上1層侵透無菌水的滅菌濾紙，保鮮膜封口。看發(fā)病癥狀是否與原來癥狀相同，然后再次分離病葉上的孢子，看孢子形態(tài)特征與原分離菌株形態(tài)是否相同。

1.2.1.3ITS保守序列鑒定PCR擴(kuò)增采用真菌ITS區(qū)段的通用引物。ITS1：5′-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。反應(yīng)體系如下：PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為20.0 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.0 μL，2.0 mmol/L dNTP 2.0 μL，25.0 mmol/L MgCl21.2 μL，20.0 μmol/L 引物ITS1 0.2 μL，20.0 μmol/L引物ITS4 0.2 μL，5.0 U/μLTaqDNA聚合酶0.1 μL，模板DNA 10.0～20.0 ng，ddH2O補(bǔ)充至20.0 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)定：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。取3 μL上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1×TAE制備1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行點樣，在5 V/cm恒電壓條件下電泳30 min后，取出凝膠在紫外燈下觀察并照相。剩余產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。擴(kuò)增產(chǎn)物回收、測序后，將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，進(jìn)行菌株鑒定，并構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2病原菌C22菌株的生物學(xué)特性研究

1.2.2.1培養(yǎng)基對菌絲生長的影響選用PDA培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基、玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基、PDA+玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基、PSA+玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和Czapek培養(yǎng)基，用直徑為0.5 cm的打孔器打取PDA培養(yǎng)基上的菌落邊緣，菌絲塊分別接種在各種培養(yǎng)基的平板中央，在26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。接種4 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理重復(fù)4次，取菌落直徑的平均值，同時觀察菌落形態(tài)，主要記錄菌落邊緣規(guī)則程度、菌落的致密程度、菌落正反兩面的顏色、菌落的凸起情況以及菌落的光滑程度等培養(yǎng)性狀。

1.2.2.2不同溫度對菌株C22菌絲生長的影響將培養(yǎng)好的分離菌，用打孔器打成直徑為0.5 cm的菌餅，移于直徑為 9.0 cm 的PDA平板中央。設(shè)10、15、20、25、28、37 ℃共6個溫度梯度，每個溫度4皿(4次重復(fù))。4 d后測量菌落直徑。

1.2.2.3不同pH值對菌株C22菌絲生長的影響用 1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值分別為5、6、7、8、9、10、11，將培養(yǎng)6 d的菌塊置于各種pH值的平板中央(4次重復(fù))，在28 ℃下培養(yǎng)。4 d后取出培養(yǎng)菌，觀察菌落的生長特征，測定菌落大小。

1.2.2.4不同碳源對菌株C22菌絲生長的影響以固體Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再分別以蔗糖、麥芽糖、乳糖、D-木糖、D-果糖、可溶性淀粉替換原Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖(使最終參試培養(yǎng)基中的純碳含量為 0.701 8 g/L)，配制成含有不同碳源的培養(yǎng)基，經(jīng)高壓滅菌后接種(4次重復(fù))。置于 28 ℃ 下培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長特征，測定菌落直徑。

1.2.2.5不同氮源對菌株C22菌絲生長的影響以固體Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用L-精氨酸、L-絲氨酸、L-賴氨酸、L-谷氨酰胺、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-纈氨酸、蘇氨酸、甘氨酸替代NaNO3(純氮0.329 4 g/L)作氮源，配成含有不同氮源的培養(yǎng)基，高壓滅菌后接種(4次重復(fù))。置于28 ℃下培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長特征，測定菌落直徑。

1.2.2.6光照對菌株C22菌絲生長的影響將直徑為 0.5 cm 的菌絲塊接種于PDA平板中央，分別置于全日光照、全日黑暗2種條件下，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(重復(fù)4次)，5 d 后測量菌落直徑。

2　結(jié)果與分析

2.1　玉米葉斑病病原菌鑒定

2.1.1鏈格孢霉葉斑病病害癥狀2016年2月于海南省三亞市田獨鎮(zhèn)南濱農(nóng)場玉米南繁基地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鏈格孢菌主要在玉米生長后期危害葉片、葉鞘及苞葉。初期病部出現(xiàn)水漬狀小圓斑點，逐漸擴(kuò)展成橢圓形至近圓形的病斑，中央灰白色至純白色，邊緣紅褐色，病健部交界明顯。病斑擴(kuò)展不受葉脈限制，大小為(0.5～1.5)cm×(0.5～0.8)cm。后期病部可見黑色霉層，一些病斑中間破裂穿孔，嚴(yán)重的整株葉片發(fā)病直至葉片死亡。采集病葉分離純化得到病原菌C22菌株。

2.1.2病原菌C22菌株的形態(tài)特征觀察C22菌株菌落的形態(tài)學(xué)鑒定見圖1，在PDA培養(yǎng)基上該病原菌菌落呈圓形或近圓形，墨綠色或黑色；氣生菌絲旺盛，灰白色(圖1-A、圖1-B)；分生孢子梗淡褐色，直或稍彎曲；分生孢子大小為(18～42)μm×(6～15)μm，單生或簇生，一般簇生2～6個，形狀變化極大，呈卵形、橢圓形、倒棍棒形，表面有縊縮，無喙或喙短，褐色至暗褐色，光滑或具瘤，孢痕明顯，具橫膈膜1～7個，多為4～5個(圖1-C)。因此，將其初步鑒定為鏈格孢菌(Alternariaalternata)。

2.1.3C22菌株的柯赫氏法則驗證葉片發(fā)病后首先出現(xiàn)水漬狀小點，擴(kuò)大后為圓形葉斑，邊緣黃褐色。許多葉斑連成不定型大片病斑，病情發(fā)展迅猛(圖2-A)。從病斑中分離出的病原菌接種至玉米葉片的發(fā)病癥狀(圖2-B)與原葉片表現(xiàn)相同，分離后獲得與原分離菌株相同形態(tài)的病原真菌，結(jié)果顯示，供試菌株即為所觀察到的玉米葉斑病的病原菌。

2.1.4C22菌株的ITS保守序列鑒定由C22菌株的ITS保守區(qū)PCR擴(kuò)增電泳圖(圖3)可知，C22菌株均能擴(kuò)增出1條650 bp左右的條帶。經(jīng)NCBI比對顯示，C22菌株與鏈格孢屬(Alternaria)幾株真菌序列相似性最高。由圖4可知，C22菌株與GenBank中已報道的鏈格孢(Alternariaalternata)、細(xì)極鏈格孢(Alternariatenuissima)、蕓薹鏈格孢(Alternariabrassicae)、鏈格孢屬(Alternariasp.)等親緣關(guān)系較近，C22菌株與上述幾種鏈格孢同源性達(dá)到99%以上，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確認(rèn)致病菌是鏈格孢菌(Alternariaalternata)，為半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、暗孢科、鏈格孢屬真菌。

2.2　病原菌C22菌株的生物學(xué)特性研究

2.2.1不同培養(yǎng)基對鏈格孢菌菌絲生長的影響不同培養(yǎng)基對鏈格孢菌絲生長的影響結(jié)果見圖5、圖6。從結(jié)果可以看出，在不同培養(yǎng)基上鏈格孢菌的菌落形態(tài)有一定的差異。7種培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果表明，該病原菌在PDA、PSA、玉米綠葉煎汁、PDA+玉米綠葉煎汁、PSA+玉米綠葉煎汁、燕麥、Czapek這7種培養(yǎng)基上均能生長，且平均生長直徑在3.7～4.0 cm之間，差異不十分明顯，其中C22菌株在PDA+玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基上生長較好，在燕麥和Czapek培養(yǎng)基上生長稍弱。在PDA+玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基上該病原菌菌落形狀規(guī)則，呈圓形，墨綠色或黑色絨狀，氣生菌絲較旺盛，灰白色，有明顯輪紋；C22菌株在PSA、PDA、PSA+玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基上菌落相似，菌落直徑差異小，呈圓形或近圓形，墨綠色絨狀，氣生菌絲旺盛，有輪紋；在燕麥培養(yǎng)基上菌落形狀規(guī)則，圓形，菌落呈淺墨綠色；在Czapek和玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基上菌落呈灰白色，菌落規(guī)則，無明顯輪紋，氣生菌絲少，無色素產(chǎn)生。

2.2.2不同氮源對C22菌株菌絲生長的影響不同氮源對鏈格孢菌菌絲生長的影響見圖7、圖8，可見在所有的參試培養(yǎng)基中C22菌株的氣生菌絲稀薄，總體上除L-亮氨酸上菌落呈灰白色外，其他菌落中心均呈褐色且邊緣呈灰白色，其中以甘氨酸、L-纈氨酸、L-精氨酸、NaNO3、L-絲氨酸為氮源時，C22菌株菌絲生長較快，平均菌落直徑為3.5～3.7 cm；以L-賴氨酸、L-脯氨酸和蘇氨酸為氮源時，C22菌株菌絲生長較慢，平均菌落直徑為3.1～3.3 cm；而以L-谷氨酰胺、L-亮氨酸為氮源時C22菌株菌絲生長最慢，平均菌落直徑分別為2.4、2.8 cm。

2.2.3不同碳源對C22菌株菌絲生長的影響不同碳源對鏈格孢菌絲生長的影響見圖9、圖10，結(jié)果顯示參試的不同碳源培養(yǎng)基上C22菌株菌落顏色、直徑及氣生菌絲差異都較大，其中以蔗糖、乳糖、淀粉為碳源時C22菌株的菌落呈褐色，氣生菌絲較少；以木糖、麥芽糖、果糖和葡萄糖為碳源時C22菌株的菌落呈白色，氣生菌絲較多，且以木糖和麥芽糖為碳源時菌絲呈發(fā)散狀，以果糖和葡萄糖為碳源時菌落邊緣整齊；而對照菌絲稀薄，幾乎呈透明狀。以麥芽糖為碳源時菌絲生長最快，平均菌落直徑達(dá)到4.6 cm，其次生長較好的是可溶性淀粉培養(yǎng)基，平均菌落直徑為4.0 cm；在木糖、蔗糖、乳糖培養(yǎng)基上C22菌株平均菌落直徑分別為3.5、3.4、3.3 cm；CK、果糖、葡萄糖培養(yǎng)基上C22菌株平均直徑分別為3.1、3.0、2.7 cm。

2.2.4pH值對鏈格孢C22菌株菌絲生長的影響不同pH值對C22菌株菌絲生長的影響見圖11、圖12，C22菌株菌絲在參試pH值5～11培養(yǎng)基下的生長狀況略有不同，菌落平均直徑在3.8～4.5 cm之間；其中pH值為5、6時C22菌株的氣生菌絲生長最好，且平均菌落直徑較大，分別為4.5、4.3 cm；當(dāng)pH值為7、8、9時，C22菌株平均菌落直徑均約為3.8 cm；當(dāng)pH值為10、11時，C22菌株平均菌落直徑分別為4.0、4.2 cm；總的來說，C22菌株菌絲生長承受的pH值范圍很廣，而且試驗結(jié)果顯示C22菌株在偏酸或偏堿的情況下菌絲平均生長直徑比中性時大，但氣生菌絲則隨著堿性偏大而略顯稀薄(圖11)。

2.2.5不同光照對C22菌株菌絲生長的影響不同光照對菌絲生長的影響見圖13，該供試菌株在28 ℃條件下培養(yǎng) 24 h 后，對連續(xù)光照或黑暗處理48、96 h的菌落生長直徑進(jìn)行測定，其中在光照條件下菌絲生長稍好，但光照條件對菌絲生長速率的影響與黑暗條件下差異不明顯，總體趨勢是連續(xù)光照更有利于菌絲生長。

2.2.6不同溫度對C22菌株菌絲生長的影響不同溫度對菌絲生長的影響見圖14，不同溫度對病原菌C22菌株菌絲生長速率的影響很大，病原菌在供試溫度范圍內(nèi)均能生長，適宜菌絲生長的溫度范圍為20～30 ℃，菌絲生長速率隨溫度的升高而增大，不同溫度之間差異較明顯，20 ℃以下及30 ℃以上生長速率明顯下降；其中最適宜的生長溫度為30 ℃，此時平均菌落直徑為5.2 cm。

3　結(jié)論與討論

本研究通過田間癥狀描述、形態(tài)學(xué)分析、ITS分子鑒定等，對海南省南繁區(qū)玉米葉斑病的病原菌進(jìn)行鑒定，確定是由鏈格孢菌侵染引起。試驗采用科赫氏法則、菌絲生長速率法等對玉米葉斑病病原菌進(jìn)行驗證及生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明，不同的氮源、碳源、光照、培養(yǎng)基、pH值等條件對菌絲生長均有影響。病原菌在供試培養(yǎng)基上都能生長，但生長最適培養(yǎng)基是PDA+玉米綠葉煎汁培養(yǎng)基；最適的氮源是L-纈氨酸和甘氨酸；20～30 ℃為菌絲生長較適宜的溫度范圍，其中30 ℃時菌落直徑最大，是最適宜菌絲生長的溫度；病原菌對酸堿度適應(yīng)范圍較廣，pH值為5時菌絲生長最好；光照對菌絲生長幾乎沒有影響，但長時間的光照更有利于菌絲生長。

White等對參試鏈格孢菌生物學(xué)特性的試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最適合菌絲體生長的培養(yǎng)基為PDA+玉米綠葉煎汁、PDA[7]，這與閻合研究的鏈格孢菌在PDA上生長較快[8]一致；最適宜菌絲生長的氮源是甘氨酸、L-纈氨酸、L-精氨酸、NaNO3、L-絲氨酸，此結(jié)果與魏薇的研究結(jié)果[9]基本一致，本研究數(shù)據(jù)顯示以甘氨酸、L-纈氨酸為氮源的培養(yǎng)基更適合菌絲生長，但與NaCO3差異不明顯。最適pH值為5，總體上C22菌株對酸堿度適應(yīng)范圍較廣，但在pH值為10、11的偏堿性條件下菌絲生長速率沒有下降，反而略有提高的結(jié)果與吳新穎對鏈格孢葉斑病的研究結(jié)果[10]不完全一致。光照條件對菌絲生長有一定的刺激性，但差異不明顯，總體上光照更有利于菌絲生長。菌絲生長的適宜溫度為20～30 ℃，且30 ℃時菌絲生長速率最大，與吳新穎的研究結(jié)果[10]一致。通過對玉米鏈格孢菌C22菌株生物學(xué)特性的研究，為闡明病菌生長和環(huán)境條件的關(guān)系，進(jìn)一步解釋玉米鏈格孢葉斑病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律提供了重要依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣乃華. 從國際玉米市場態(tài)勢看中國玉米經(jīng)濟(jì)發(fā)展策略[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(社會科學(xué)版)，2002(3)：22-25.

[2]楊虎. 20世紀(jì)玉米種業(yè)發(fā)展研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[3]董金皋，鄧福友，王春芬，等. 我國玉米大斑病菌生理小種的溫度效應(yīng)研究[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，1996，23(4)：305-309.

[4]李繼平，苓強(qiáng)，李敏權(quán)，等. 玉米葉點霉葉斑病菌生物學(xué)特性[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2013，40(4)：383-384.

[5]周舒揚(yáng)，汪春蕾，喬志新. 玉米鏈格孢菌葉枯病病原菌的分子鑒定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2010，6(11)：261-263.

[6]孫霞. 鏈格孢屬真菌現(xiàn)代分類方法研究[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[7]White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]. San Diego：Academic Press，1990：315-322.

[8]閻合. 甘草鏈格孢葉斑病研究[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[9]魏薇. 小薊葉片上鏈格孢菌的研究[D]. 大慶：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，2008.

[10]吳新穎. 萬壽菊鏈格孢葉斑病研究[D]. 長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.