吳　琦， 付宇辰， 閆子飛， 王少杰， 冷平生，2， 胡增輝，2

(1.北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院，北京 102206； 2.北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206)

植物的花香被譽為“花卉的靈魂”，是植物花朵釋放的次生代謝產(chǎn)物，主要是由許多低分子量、易揮發(fā)的化合物混合而成[1]。大多數(shù)花香物質(zhì)屬于三大類，即萜烯類化合物、芳香烴類化合物和脂肪酸衍生物，還包含一些氮或硫的化合物。揮發(fā)性香氣成分主要來源于花瓣、蕊柱、花萼和蜜腺等，其他花器官也能散發(fā)少量的香氣[2-3]。植物花香的組分及其相對含量與其自身的基因型、發(fā)育程度、釋放部位、溫度、光照和植物激素等有關(guān)。影響植物揮發(fā)物釋放的植物激素種類很多，如乙烯、脫落酸類、水楊酸類、茉莉酸類等等[4-6]。目前研究的相對比較熱門的激素之一是茉莉酸類激素，且已經(jīng)有相應(yīng)的試驗結(jié)果證明茉莉酸類物質(zhì)對調(diào)控植物的次生代謝作用具有顯著的影響。

茉莉酸類化合物(JAs)是植物體內(nèi)普遍存在的激素，包括茉莉酸(JA)及其衍生物，如茉莉酸甲酯(MeJA)及茉莉酸異亮氨酸復(fù)合物(JA-Ile)。茉莉酸最早由茉莉花中提取出來，可以作為信號分子廣泛參與植物的生長發(fā)育、脅迫響應(yīng)和防御反應(yīng)，在植物細胞的生理過程中起著重要的信號作用[7-8]。在大多數(shù)的研究中，施用茉莉酸類激素的常用方法是用MeJA溶液均勻噴灑在植物體表面，使MeJA經(jīng)過氣孔進入植物體內(nèi)并被在細胞質(zhì)中的酯酶水解，最終以茉莉酸形式遠距離進行信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生代謝反應(yīng)。

研究表明，MeJA能夠影響植物揮發(fā)物的釋放。桂連友等發(fā)現(xiàn)MeJA可以促進茶樹新梢中的羅勒烯釋放[9]。王立春等用不同濃度的MeJA噴灑馬尾松后，發(fā)現(xiàn)單萜類物質(zhì)α-蒎烯和β-蒎烯的釋放都明顯高于對照[10]。廖永翠對白木香懸浮細胞進行熱激處理，使內(nèi)源茉莉酸含量顯著增加，進而誘導(dǎo)了3種沉香倍半萜的生成，說明茉莉酸信號與沉香倍半萜的合成有直接的關(guān)系[11]。花香是植物釋放出的一類重要揮發(fā)性次生代謝物，但茉莉酸對植物花香影響的研究報道較少，其調(diào)控方式和機制還不清楚。

百合(Liliumspp.)是百合科(Liliaccae)百合屬(Lilium)所有種的總稱，其花朵碩大，花色豐富，常具有芳香氣味，有很高的觀賞價值，是世界五大切花之一。為了探索茉莉酸對花香釋放的影響，本試驗選用濃香型東方百合西伯利亞(Lilium‘Siberia’)為試驗材料，經(jīng)過不同濃度的MeJA溶液處理后，使用頂空套袋法采集花朵揮發(fā)物，利用自動熱脫附-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析揮發(fā)物成分及含量，探究不同濃度MeJA溶液對西伯利亞百合花朵揮發(fā)物合成及釋放的影響， 為揭示茉莉酸類激素的作用機制，進而對花香進行調(diào)控和育種提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

本試驗使用荷蘭進口的西伯利亞百合種球(北京荷景良苑貿(mào)易有限公司)，直徑14～16 cm，于2016年4月種植于北京農(nóng)學(xué)院園林植物實踐基地內(nèi)。草炭和蛭石按1 ∶1的比例混合作為栽培基質(zhì)，日光溫室溫度控制在23～26 ℃，濕度60%～70%，通風(fēng)良好，每3 d澆一次水，生長周期大約為 90 d，待花蕾碩大并開始顯色，即可準備采集花朵揮發(fā)物。選擇長勢健壯一致，無病蟲害，且處于盛花期的植株采集花香。

1.2　處理方法

將購自Sigma公司的95%茉莉酸甲酯用5%的無水乙醇溶解，配制成50、200、600 μmol/L的MeJA溶液。選取晴朗無云的天氣，于11：00—14：00對西伯利亞百合花瓣均勻噴施3種濃度的MeJA溶液，噴施后立即套袋熏蒸。熏蒸1 h后將熏蒸袋取下并用脫脂棉輕輕擦拭花朵，除去花瓣表面殘留的液滴，進行花朵揮發(fā)物收集。設(shè)置未做任何處理的植株作為空白對照，每種處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3　香氣采集

采用動態(tài)頂空法進行花朵揮發(fā)物收集。將干凈的采樣袋(355 mm×508 mm，Reynolds，USA)套在百合花朵上，連接大氣采樣儀進行3次抽吸，進氣過程經(jīng)過裝有活性炭的干燥塔除雜，完成全部抽吸后靜置10 min。用無味硅膠管連接 Tenax-GR 吸附管(60-80 mesh，Chrompack)，開啟大氣采樣儀，設(shè)定采集流速為0.1 L/min，采樣時長為20 min。采集花香揮發(fā)物前先采集棚內(nèi)空氣作為對照。

1.4　花香分析

采用自動熱脫附-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進行花香成分及含量的鑒定和分析。自動熱脫附(TurboM-atrix 650，PerkinElmer)條件：260 ℃條件下一級熱脫附10 min，-25 ℃冷卻3 min，300 ℃保持5 min進行二級熱脫附。氣相色譜(Clarus 600，PerkinElmer)條件：色譜柱DB-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣He；運行程序為40 ℃保持2 min，4 ℃/min的速度升溫至160 ℃，再以20 ℃/min升溫至270 ℃，保持 3 min。質(zhì)譜(Clarus 600T，PerkinElmer)條件：電離模式EI；電子能量70 eV；質(zhì)譜掃描范圍29～600 amu；接口溫度250 ℃；離子源溫度220 ℃。

1.5　香氣成分鑒定與分析

使用TurboMass Ver5.4.2軟件對總離子流分析，根據(jù)NIST08數(shù)據(jù)庫的檢索鑒定揮發(fā)物的成分，記錄整理峰面積值。用α-蒎烯做外標，進一步確定各化合物成分的釋放量。使用WPS表格統(tǒng)計分析結(jié)果并繪制表格。使用SPSS16進行顯著性分析，顯著性水平P<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1　西伯利亞百合花朵揮發(fā)物總釋放量分析

圖1是不同濃度MeJA處理的西伯利亞百合花香總離子流圖，經(jīng)過MeJA處理的西伯利亞百合離子流圖中的峰數(shù)量和峰面積比未經(jīng)處理的對照組明顯增多，200 μmol/L MeJA處理組最為突出。圖2是對各個峰分析后得到的不同MeJA濃度下花香揮發(fā)物總釋放量統(tǒng)計結(jié)果，結(jié)果顯示，隨著噴施的MeJA溶液濃度增加，花香揮發(fā)物總釋放量呈先下降后上升的趨勢。用50 μmol/L的MeJA溶液噴施花朵后，揮發(fā)物釋放總量有明顯的下降趨勢，僅為空白對照的60%。而用 200 μmol/L和600 μmol/L的MeJA溶液噴施后，揮發(fā)物含量有顯著的提高，特別是經(jīng)過200 μmol/L的MeJA溶液噴施后，揮發(fā)物釋放量比空白對照增加了1/5，效果最為明顯。

2.2　西伯利亞百合花朵不同種類揮發(fā)物相對釋放量的差異

表1顯示了西伯利亞百合花香揮發(fā)物成分歸類數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果，其花香揮發(fā)物的成分主要可以分為萜烯類、酯類、醇類、脂肪烴類、芳香烴類、醛類、酮類和其他八大類，約50多種不同的揮發(fā)物成分，其中種類最多的是酯類，其次是萜烯類，占總體的一半以上。經(jīng)過200 μmol/L和600 μmol/L的MeJA溶液噴施的西伯利亞百合釋放物質(zhì)種類基本持平，僅有個別物質(zhì)出現(xiàn)輕微差異，均比對照組多。

對物質(zhì)進行歸類和釋放量的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)花香揮發(fā)物中萜烯類和酯類的平均釋放量相對較高，隨著噴施濃度的增加，酮類、其他類物質(zhì)的釋放含量呈逐漸上升趨勢(圖3)。萜烯類(圖3-A)是西伯利亞百合花香的主要物質(zhì)，其次是酯類(圖3-B)，醇類(圖3-C)、脂肪烴類(圖3-D)、芳香烴類(圖3-E)、醛類(圖3-F)、 酮類(圖3-G)和其他類物質(zhì)(圖3-H)的含量依次減少。經(jīng)過不同濃度MeJA溶液噴施后，萜烯類、醇類、醛類、酮類和其他類物質(zhì)隨著MeJA含量的增加，釋放量呈上升趨勢，最高時可達到之前的2倍左右。酯類的釋放量呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢，經(jīng)過200 μmol/L的MeJA溶液噴施后， 其釋放量幾乎是空白對照的5倍。脂肪烴類物質(zhì)隨MeJA溶液濃度升高，釋放量先下降后升高；芳香類的釋放量對MeJA溶液濃度的改變幾乎無響應(yīng)，僅為對照的13%。部分類別的花香揮發(fā)物在經(jīng)過50 μmol/L的MeJA溶液處理后，釋放量有不同程度的下降，而隨著濃度的增加，花香釋放量逐漸增加。

表1　不同濃度MeJA對西伯利亞百合花香揮發(fā)物種類數(shù)量的影響

2.3　西伯利亞百合花朵主要揮發(fā)物釋放量隨溶液濃度的變化

本研究從50多種不同的揮發(fā)物成分中篩選出了8種代表性成分，并對這8種成分的釋放量進行分析。從圖4可以看出，月桂烯和羅勒烯是西伯利亞百合最主要的花香成分，還包括有一些其他的萜烯類和酯類物質(zhì)。大部分主要物質(zhì)如月桂烯(圖4-A)、萜品烯(圖4-E)、丁酸乙酯(圖4-F)、正己酸乙酯(圖4-G)和惕各酸乙酯(圖4-H)在經(jīng)過不同濃度MeJA溶液噴施后，隨著溶劑濃度升高，表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，在200 μmol/L的MeJA噴施后，揮發(fā)量最高，大部分都比空白對照增加了3～6倍，甚至更多。羅勒烯(圖4-B)和波斯菊萜(圖4-C)的釋放量隨著MeJA濃度的升高逐漸升高，在600 μmol/L時達到最高，分別比對照提高了7倍和1.5倍。萜品油烯(圖4-D)在200 μmol/L和600 μmol/L的MeJA溶液噴施后釋放量沒有特別明顯的差異。

3　討論

花香是通過植物次生代謝反應(yīng)產(chǎn)生的，是花卉的重要觀賞性狀之一，決定著花朵整體的觀賞價值，甚至比花色和花型更能影響消費者的決定[12]，因此有關(guān)的花香研究和花香育種工作逐漸成為近些年研究的熱點內(nèi)容。

本試驗用MeJA溶液噴施西伯利亞百合花朵，大部分花香揮發(fā)物的釋放量都有一定程度的增加，這與鞏莎等得到的結(jié)果[13]相似。在已有的研究成果中也發(fā)現(xiàn)花青素、生物堿、黃酮類、萜類[14-16]等次生代謝產(chǎn)物均受到茉莉酸信號的調(diào)控。

本研究中用不同濃度的MeJA對西伯利亞百合花朵進行噴施，大部分花香揮發(fā)物在經(jīng)200 μmol/L或600 μmol/L的MeJA處理后，花香揮發(fā)物增加量比較明顯，低濃度的MeJA溶液(50 μmol/L)反而對百合花瓣的揮發(fā)物釋放產(chǎn)生了抑制。王煥發(fā)現(xiàn)高濃度(600 μmol/L)的MeJA溶液比低濃度(200 μmol/L)的MeJA溶液更能有效促進陽春砂果皮和種子團中萜類物質(zhì)的積累，而在葉片中，高濃度的MeJA溶液(600 μmol/L)則產(chǎn)生了抑制作用[17]。因此推測不同濃度MeJA溶液對不同部位的作用效果不一致。

廖永翠發(fā)現(xiàn)在白木香愈傷組織中，茉莉酸核心合成酶基因脂氧合酶(LOX)、丙二烯氧化合酶(AOS)和丙二烯氧化物環(huán)化酶(AOC)，JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的冠菌素不敏感蛋白1(COI1)、茉莉酸ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白(JAZ)、JAZ互作子蛋白(NINJA)、轉(zhuǎn)錄因子MYC2等基因?qū)eJA的響應(yīng)比熱激傷害和機械傷害更為強烈，在0.5 h時基因的表達量急速增加，在4 h時表達量達到最高[11]。由此可以推斷，這些基因的激活可以有效促進植物內(nèi)源茉莉酸的積累，打破植物體原有的激素平衡，并進一步誘導(dǎo)植物次生代謝反應(yīng)的進行，增加了如萜烯類等次生代謝產(chǎn)物的合成。也有研究表明，萜類骨架及揮發(fā)性萜類生物合成途徑中部分基因的表達與JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，且均為正相關(guān)，如JAZ和MYZ2基因就和甲羥戊酸(MVA)途徑中的乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(AACT)、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)、羥基甲基戊二酰-CoA合成酶(HMGS)等基因；2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑中的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-磷酸合酶(HDS)等基因有極強相關(guān)性。Su等發(fā)現(xiàn)噴施MeJA溶液可以使倍半萜合成途徑中的(反)-β-法呢烯基因的表達上調(diào)，且(反)-β-法呢烯的釋放量也隨之顯著上升[18]。魏潔書通過試驗驗證得出MeJA可以有效誘導(dǎo)陽春砂MEP途徑中萜類合成關(guān)鍵酶基因羥基甲基戊二酰-CoA還原酶(HMGR)和DXR的表達，特別是對低濃度MeJA溶液的響應(yīng)非常敏感且明顯[19]。因此，可以推測茉莉酸合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，如LOX、AOS和AOC等和萜類合成代謝途徑中的某些基因具有很強的關(guān)聯(lián)性，可以誘導(dǎo)萜類合成代謝中MVA途徑和MEP途徑中關(guān)鍵基因的表達，促進花香揮發(fā)物的合成和釋放。

綜上所述，茉莉酸類激素對西伯利亞百合花香的釋放促進作用明顯，但其對于萜烯類合成途徑的調(diào)控機制還有待深入研究，因此，將茉莉酸合成途徑中的關(guān)鍵基因作為切入點，探究其與萜烯合成途徑中關(guān)鍵基因的表達情況之間的關(guān)系，是今后從基因水平上進行花香調(diào)控和花香育種的有效途徑之一。

參考文獻：

[1]孔瀅，孫明，潘會堂，等. 花香代謝與調(diào)控研究進展[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，34(2)：146-154.

[2]Dudareva N，Pichersky E. Biology of floral scent[M]. CRC Press，2006.

[3]Borda A M，Clark D G，Huber D J，et al. Effects of ethylene on volatile emission and fragrance in cut roses：The relationship between fragrance and vase life[J]. Postharvest Biology & Technology，2011，59(3)：245-252.

[4]Lorenzo O，Solano R.Molecular players regulating the jasmonate signalling network[J]. Current Opinion in Plant Biology，2005，8(5)：532-540.

[5]Degenhardt D C，Refi-Hind S，Stratmann J W，et al. Systemin and jasmonic acid regulate constitutive and herbivore-induced systemic volatile emissions in tomato，Solanum lycopersicum[J]. Phytochemistry，2010，71(17/18)：2024-2037.

[6]Jiang Y F，Ye J Y，Li S，et al. Regulation of floral terpenoid emission and biosynthesis in sweet basil (Ocimumbasilicum)[J]. Journal of Plant Growth Regulation，2016，35(4)：1-15.

[7]Zhu J H，Peng S Q. Jasmonic acid and its signal transmission[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2006，26(10)：200-206.

[8]Shitan N，Sugiyama A，Yazaki K. Functional analysis of jasmonic acid-responsive secondary metabolite transporters[J]. Jasmonate Signaling，2013，1011：241-250.

[9]桂連友，陳宗懋，劉樹生. 外源茉莉酸甲酯處理茶樹對茶尺蠖幼蟲生長的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(2)：302-307.

[10]王立春，任琴，許志春，等. 茉莉酸甲酯對馬尾松松針萜烯類揮發(fā)物及馬尾松毛蟲生長發(fā)育的影響[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，30(1)：79-84.

[11]廖永翠. 茉莉酸信號途徑參與調(diào)控沉香倍半萜生物合成的分子機制研究[D]. 北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2015.

[12]Sexton R，Stopford A P，Moodie W T，et al. Aroma production from cut sweet pea flowers(Lathyrusodoratus)：the role of ethylene[J]. Physiologia Plantarum，2005，124(3)：381-389

[13]鞏莎，張艷峰，薛皎亮，等. MeJA處理和蚧蟲危害對棗樹揮發(fā)物的影響[J]. 生物學(xué)雜志，2012，29(5)：43-48.

[14]Chen H，Jones A，Howe G.Constitutive activation of the jasmonate signaling pathway enhances the production of secondary metabolites in tomato[J]. FEBS Letters，2006，580(11)：2540-2546.

[15]胡龍嬌. 誘導(dǎo)子及光質(zhì)對半夏生長與次生代謝影響研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[16]梁曉薇. 茉莉酸甲酯對甘草次生代謝的調(diào)控[D]. 廣州：廣東藥科大學(xué)，2016.

[17]王煥. MeJA影響陽春砂揮發(fā)性萜類和轉(zhuǎn)錄組變化的研究[D]. 廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[18]Su S，Liu X，Pan G，et al. In vitro characterization of a (E)-β-farnesene synthase fromMatricariarecutitaL. and its up-regulation by methyl jasmonate.[J]. Gene，2015，571(1)：58-64.

[19]魏潔書. 基于陽春砂HMGR和DXR基因的萜類化合物生物合成調(diào)控研究[D]. 廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2013.