許換平， 郭慧杰， 張　林， 閆紅飛， 孟慶芳

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心/河北省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北保定 071000)

由專性寄生菌小麥隱匿柄銹菌(Pucciniatriticina)引起的小麥葉銹病是小麥生產(chǎn)上的重要病害之一，是世界上分布范圍較廣的病害，一般造成產(chǎn)量損失5%～45%，有時(shí)甚至更高[1]。我國(guó)曾在1969年、1973年、1975年、1979年、1990年發(fā)生流行小麥葉銹病[2]。2015年、2016年，筆者所在研究室的人員在采集小麥葉銹病病菌標(biāo)樣的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，小麥葉銹病發(fā)病率較高，尤其是2015年的發(fā)病率較高，發(fā)病面積較廣。尤其是在淮河以南地區(qū)，小麥葉銹病發(fā)病早，嚴(yán)重度高，嚴(yán)重影響了小麥的產(chǎn)量。

小麥葉銹病在我國(guó)的侵染循環(huán)包括越夏、秋苗發(fā)病、越冬、春季流行等4個(gè)過(guò)程。小麥葉銹病病菌可以產(chǎn)生性孢子、銹孢子、夏孢子、冬孢子、擔(dān)孢子等5種孢子，其中夏孢子在病害循環(huán)中占有重要的地位，我國(guó)小麥葉銹病的發(fā)生主要依靠夏孢子的侵染和傳播，在夏孢子傳播和侵染過(guò)程中，環(huán)境條件的改變會(huì)影響其存活及病害的發(fā)生情況，特別是紫外線會(huì)導(dǎo)致毒性的變化[3-5]和病菌的死亡[6-7]。但由于人為原因?qū)е鲁粞鯇涌斩?，使得地球表面上的紫外線強(qiáng)度越來(lái)越強(qiáng)，不斷加強(qiáng)的紫外線會(huì)影響植物病原菌、寄主植物和植物病害[8]。當(dāng)前，紫外線已經(jīng)被認(rèn)為是影響植物病害發(fā)生和流行的最重要的環(huán)境因素之一[9-10]。因此，加強(qiáng)研究紫外線對(duì)植物病原菌和植物病害的影響，已經(jīng)成為控制植物病害和保證糧食安全的重中之重。紫外線誘變也是獲得銹菌突變菌株的重要手段。Flor等采用紫外誘變的方法，獲得了致病性發(fā)生變化的亞麻銹菌菌株[11-12]。Maddison等研究了自然條件下紫外線對(duì)銹病病菌遠(yuǎn)距離傳播的影響[13]。紫外線誘變?cè)跅l銹病病菌研究中的應(yīng)用較多，商鴻生等通過(guò)紫外線誘變獲得了多個(gè)毒性發(fā)生突變的菌株[3，14]；黃麗麗等對(duì)突變菌株進(jìn)行了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記遺傳多樣性分析，初步認(rèn)為紫外線可以使小麥條銹病病菌基因組DNA發(fā)生較大的變化[4]。在小麥葉銹病病菌研究中，鹿巍對(duì)小麥葉銹病病菌05-5-46單孢菌株進(jìn)行紫外誘變，獲得了3株穩(wěn)定遺傳的小麥葉銹病病菌突變菌株Mut1、Mut2、Mut3[15]。本研究采用紫外誘變法，獲得毒性發(fā)生變異的突變菌株，并進(jìn)一步探究紫外線對(duì)小麥葉銹病病菌孢子萌發(fā)和流行學(xué)因素的影響，以期為小麥葉銹病病菌致病性的研究提供材料和理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株小麥葉銹病病菌單孢菌株12-5-1384-1和誘變菌株1384-10-B-1，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥葉銹病研究室保存。其中，單孢菌株12-5-1384-1在鑒別寄主TcLr1上的侵染型為“；”，誘變1384-10-B-1菌株是由菌株12-5-1384-1在1 600 μW/cm2紫外強(qiáng)度下照射10 min后篩選得到，在鑒別寄主TcLr1上的侵染型為“3”。

1.1.2供試小麥品種小麥品種為鄭州5389，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥葉銹病研究室保存。

1.1.3試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)試驗(yàn)于2015年11月至2016年5月，在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院分子植物病理學(xué)與生物防治實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1誘變劑量及方法取10 mg新鮮的小麥葉銹病病菌夏孢子，置于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，保濕水化12 h后，在 1 600 μW/cm2紫外強(qiáng)度下，分別照射10、20、30 min，以未照射處理作為對(duì)照，照射后用毛筆收集夏孢子，均勻抖落在1%的水瓊脂培養(yǎng)基(10 g瓊脂粉+1 L蒸餾水)平板上，加蓋后放在20 ℃黑暗環(huán)境中，6 h后顯微鏡下檢查夏孢子的萌發(fā)情況。每個(gè)處理隨機(jī)檢查300個(gè)孢子，以夏孢子芽管長(zhǎng)度超過(guò)夏孢子直徑一半作為萌發(fā)的記載標(biāo)準(zhǔn)[16]，每個(gè)處理重復(fù)3次。計(jì)算孢子萌發(fā)率和相對(duì)萌發(fā)率，孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100%，相對(duì)萌發(fā)率=處理組孢子萌發(fā)率/對(duì)照組孢子萌發(fā)率×100%。根據(jù)前人對(duì)最適誘變劑量的研究，原始菌株的夏孢子經(jīng)紫外線照射后，致死率為90%左右時(shí)確定為最適誘變劑量。

1.2.2誘變菌株和原始菌株流行學(xué)研究將10 mg誘變菌株和原始菌株的夏孢子分別水化后，在1 600 μW/cm2紫外強(qiáng)度下分別照射0、10、20、30 min，將處理后的新鮮夏孢子收集于裝有10 mL 稀釋1 000倍的吐溫-20水溶液的小噴壺中，均勻噴灑于鄭州5389小麥幼苗葉片上，葉片旁邊放置載玻片，以觀察記錄單位面積噴灑小麥葉銹病病菌的夏孢子數(shù)。16～20 ℃黑暗保濕14～16 h后，移入16～20 ℃的溫室內(nèi)培養(yǎng)。觀察并記錄流行學(xué)指標(biāo)[潛育期、侵染效率、病斑擴(kuò)展率、產(chǎn)孢量、病情發(fā)展曲線下面積(area under the disease-progress curve，簡(jiǎn)稱AUDPC)等]。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.2.1潛育期的標(biāo)準(zhǔn)將夏孢子接種于葉片至葉片上第1個(gè)夏孢子堆突破表皮時(shí)的時(shí)間為潛育期，在葉片出現(xiàn)褪綠斑后，每天觀察葉片病斑的變化，記錄第1個(gè)夏孢子堆突破表皮的時(shí)間。

1.2.2.2侵染效率的計(jì)算顯微觀察記錄載玻片上單位面積噴灑的夏孢子數(shù)量，作為噴灑于葉片上的單位面積的夏孢子數(shù)量。用毫米尺測(cè)量葉片的長(zhǎng)度和最寬處的寬度，計(jì)算葉片面積。當(dāng)葉片上出現(xiàn)侵染點(diǎn)后，統(tǒng)計(jì)葉片上侵染點(diǎn)的數(shù)量，并計(jì)算侵染效率。葉片面積=葉片長(zhǎng)×葉片寬×0.8；侵染效率=葉片上侵染點(diǎn)數(shù)量/(單位面積接種夏孢子的數(shù)量×葉片面積)。

1.2.2.3病斑擴(kuò)展率計(jì)算在接種夏孢子的葉片剛剛出現(xiàn)孢子堆時(shí)，選擇只有單個(gè)孢子堆的葉片，用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量孢子堆的長(zhǎng)、寬，并記錄，計(jì)算病斑面積，每2 d測(cè)1次，直到孢子堆不再擴(kuò)展為止。

病斑擴(kuò)展率=(第2天病斑面積-第1天病斑面積)/第1天病斑面積。

1.2.2.4產(chǎn)孢量待葉片上的孢子堆突破表皮后，每2 d收集1次夏孢子，直至不再產(chǎn)生新的夏孢子，將收集的夏孢子懸浮于10 mL無(wú)菌水中，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理的產(chǎn)孢量。

2　結(jié)果與分析

2.1　紫外線對(duì)小麥葉銹病病菌夏孢子萌發(fā)率的影響

由表1可知，在同一紫外線強(qiáng)度下，隨著紫外線照射時(shí)間的延長(zhǎng)，2種菌株的相對(duì)萌發(fā)率均在逐漸降低。處理時(shí)間為 0 min 時(shí)，菌株12-5-1384-1夏孢子的萌發(fā)率為96.98%，而誘變菌株1384-10-B-1夏孢子的萌發(fā)率僅為72.94%；當(dāng)處理時(shí)間為10 min時(shí)，菌株12-5-1384-1夏孢子的萌發(fā)率低于誘變菌株1384-10-B-1夏孢子的萌發(fā)率，說(shuō)明原始菌株對(duì)紫外線較敏感。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2種菌株的相對(duì)萌發(fā)率逐漸接近，說(shuō)明隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，突變菌株的抗紫外線能力逐漸降低。

表1　紫外線對(duì)小麥葉銹病病菌夏孢子萌發(fā)率的影響

2.2　紫外線對(duì)小麥葉銹病病菌流行學(xué)參數(shù)的影響

2.2.1紫外線對(duì)小麥葉銹病病菌潛育期的影響由圖1可知，處理時(shí)間為0 min時(shí)，菌株12-5-1384-1的潛育期為 9 d，誘變菌株1384-10-B-1的潛育期為7 d，潛育期縮短 2 d；處理時(shí)間為10、20、30 min時(shí)，菌株12-5-1384-1的潛育期分別為10、10、11 d，每個(gè)處理中，誘變菌株1384-10-B-1的潛育期均縮短2 d。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2種菌株的潛育期均延長(zhǎng)，說(shuō)明紫外線可以延長(zhǎng)小麥葉銹病病菌的潛育期。

2.2.2紫外線對(duì)小麥葉銹病病菌侵染效率的影響由圖2可知，處理時(shí)間為0 min時(shí)，菌株12-5-1384-1的侵染效率為30.33×10-5，誘變菌株1384-10-B-1的侵染效率為38.96×10-5，誘變菌株的侵染效率提高了28.45%。處理時(shí)間從0 min增加到10 min時(shí)，菌株12-5-1384-1的侵染效率降低了89.17%，誘變菌株1384-10-B-1的侵染效率降低了91.13%。隨著處理時(shí)間的進(jìn)一步增加，2種菌株的侵染效率均逐漸降低，對(duì)照組(處理0 min)與各處理組之間差異顯著(P<0.05)，各處理組之間差異不顯著；處理時(shí)間相同時(shí)，誘變菌株的侵染效率總是高于原始菌株。

2.2.3紫外線對(duì)小麥葉銹病病菌病斑擴(kuò)展率的影響由圖3可知，菌株12-5-1384-1的病斑擴(kuò)展率變化較規(guī)律，各處理之間的變化趨勢(shì)一致，病斑擴(kuò)展率均在接種后第11天達(dá)到最高，之后隨著時(shí)間的增加，病斑擴(kuò)展率逐漸降低，至第19天時(shí)又出現(xiàn)1個(gè)小高峰。菌株1384-10-B-1處理 0 min 組和10 min組的最大病斑擴(kuò)展率均出現(xiàn)在接種后第13天，且在第17天時(shí)又出現(xiàn)1個(gè)小高峰；處理20 min組和 30 min 組，最大病斑擴(kuò)展率均出現(xiàn)在第15天，后期沒(méi)有出現(xiàn)小高峰。

2.2.4紫外照射對(duì)葉銹病病菌產(chǎn)孢量的影響由圖4可知，處理時(shí)間為0 min時(shí)，菌株12-5-1384-1的產(chǎn)孢量為 116.39×104個(gè)，誘變菌株1384-10-B-1的產(chǎn)孢量為145.46×104個(gè)，誘變菌株的產(chǎn)孢量提高了24.98%。處理時(shí)間從0 min增加至10 min時(shí)，菌株12-5-1384-1和誘變菌株1384-10-B-1的產(chǎn)孢量分別降低了84.11%、83.83%；隨著處理時(shí)間的進(jìn)一步增加，2種菌株的產(chǎn)孢量均逐漸降低，對(duì)照組(處理0 min)與處理組之間差異顯著(P<0.05)，各處理組之間差異不顯著；處理時(shí)間相同時(shí)，誘變菌株的產(chǎn)孢量總是高于原始菌株。

2.2.5紫外線對(duì)小麥葉銹病病菌AUDPC的影響由圖5可知，隨著接種后時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理的AUDPC均在增加，且對(duì)照組(處理0 min)顯著高于各處理組(P<0.05)。就同一菌株而言，接種后相同時(shí)間內(nèi)隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的AUDPC逐漸降低。同一菌株接種后相同時(shí)間內(nèi)對(duì)照組的AUDPC與各處理組之間差異顯著(P<0.05)，各處理組之間差異不顯著。紫外線照射時(shí)間相同時(shí)，原始菌株12-5-1384-1的AUDPC總是低于誘變菌株1384-10-B-1的AUDPC。

3　結(jié)論與討論

突變是促使病原菌發(fā)生遺傳多樣性變化的基本因素，因此在研究中，對(duì)菌株進(jìn)行誘變，篩選突變體是研究致病機(jī)制和某些基因功能的基本方法[17-18]。紫外線導(dǎo)致DNA發(fā)生變異的根本在于入射光子的波長(zhǎng)[19-23]，紫外線誘導(dǎo)的DNA變異可以由紫外線B或紫外線A吸收，以及光敏作用直接觸發(fā)[19，22，24]，發(fā)生的變異是非定向的，正向的毒性突變是導(dǎo)致抗病品種喪失抗銹性的原因，而反向的非毒性變異在篩選過(guò)程中容易丟失。本研究采用紫外誘變的方法，以TcLr1為鑒別寄主，選擇在TcLr1上侵染型為“；”的12-5-1384-1單孢菌株為原始菌株，經(jīng)紫外線誘變后，篩選出侵染型變?yōu)椤?”的菌株，進(jìn)一步研究紫外線對(duì)其流行學(xué)參數(shù)的影響。

本研究的結(jié)果表明，紫外線照射會(huì)抑制葉銹病病菌夏孢子的萌發(fā)，2株葉銹病病菌對(duì)紫外線照射的容忍度是不同的，誘變菌株的容忍度大于原始菌株；在紫外線照射之后，菌株的侵染效率、病斑擴(kuò)展率、產(chǎn)孢量和AUDPC均下降，潛育期增長(zhǎng)，紫外線照射在某種程度上傷害了葉銹病病菌夏孢子，導(dǎo)致一部分夏孢子不能萌發(fā)、甚至死亡，但即便如此，仍有一些幸存的夏孢子能夠萌發(fā)，曾有多名研究者報(bào)道過(guò)紫外線輻射可以延遲幸存真菌分生孢子的萌發(fā)[25-27]；另外，真菌孢子自身的某些生理?xiàng)l件可能會(huì)幫助其抵抗紫外照射的損害并修復(fù)其帶來(lái)的傷害[28]，但這個(gè)過(guò)程需要時(shí)間，這可能是處理時(shí)間越長(zhǎng)，潛育期越長(zhǎng)的原因。這些結(jié)果表明，誘變菌株和原始菌株相比，原始菌株對(duì)紫外線照射更加敏感，在同樣的紫外線照射條件下，突變菌株更具生存優(yōu)勢(shì)。在此研究中突變菌株被命名為誘變菌株1384-10-B-1，自然界中該生理小種的毒性高于單孢菌株12-5-1384-1這一生理小種，近幾年誘變菌株1384-10-B-1出現(xiàn)的比例高于單孢菌株12-5-1384-1，可能是因?yàn)檎T變菌株1384-10-B-1比單孢菌株12-5-1384-1更適合現(xiàn)在的生存環(huán)境。因此，可以初步認(rèn)為紫外線可能是造成葉銹病病菌生理小種不斷進(jìn)化的一個(gè)重要因素，但還須做進(jìn)一步的研究。

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