李 張，徐志榮，婁佳蘭，譚小林，劉怡婷，上官桃鳳，魏賽金

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防褐化劑對(duì)南方紅豆杉愈傷組織褐化及相關(guān)物質(zhì)含量的影響

李 張，徐志榮，婁佳蘭，譚小林，劉怡婷，上官桃鳳，魏賽金*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開(kāi)發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045）

研究了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、活性炭(AC)、抗壞血酸(VC)、檸檬酸(CA)和硫代硫酸鈉(hypo) 5種防褐化劑對(duì)南方紅豆杉愈傷組織的生長(zhǎng)及褐化情況的影響。測(cè)定不同時(shí)間愈傷組織中多酚氧化酶(PPO)和過(guò)氧化物酶(POD)活性及酚類物質(zhì)含量的變化。結(jié)果表明，PVP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)效果最好；第20天時(shí)hypo處理的PPO活性最低，低于對(duì)照78.77%，第15天時(shí)VC處理的POD活性最低，低于對(duì)照604.92%；第20天時(shí)，CA處理的總酚含量最低，低于對(duì)照108.82%。所選的5種防褐化劑在降低紅豆杉細(xì)胞褐化均具有一定效果。

南方紅豆杉；愈傷組織；防褐化劑；酚類物質(zhì)；酶活性

南方紅豆杉(var.)又稱紫杉，為紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬()植物，主要分布于中國(guó)南方地區(qū)，是紅豆杉屬中分布最廣、生長(zhǎng)最快的一種，為國(guó)家一級(jí)保護(hù)樹種[1]。其含有的紫杉醇屬四環(huán)二萜酰胺類化合物，是一種對(duì)治療肺癌、卵巢癌等有特效的抗癌藥物，是當(dāng)前公認(rèn)的廣譜、活性強(qiáng)的一線抗腫瘤藥物[2-3]。傳統(tǒng)獲得紫杉醇的方法主要是從紅豆杉的根皮、莖、葉中來(lái)提取，由于提取工藝較為復(fù)雜、設(shè)備投資大、原料缺乏而嚴(yán)重受限，而采用的植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇具有很大潛力[4]。但由于紅豆杉屬植物本身特殊的生物學(xué)特性，在培養(yǎng)過(guò)程中組織和細(xì)胞常發(fā)生褐化，輕則影響組織細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，重則導(dǎo)致組織細(xì)胞死亡，已成為制約這一技術(shù)推廣的最大障礙，所以有效地防止和解決組織培養(yǎng)中的褐化是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[5]。

研究認(rèn)為，酚類物質(zhì)經(jīng)過(guò)多種氧化酶如多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）催化后形成醌類物質(zhì)，再通過(guò)聚合作用產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo)致組織呈褐色，即為褐變[6]。這種褐色物質(zhì)逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，毒害整個(gè)組織并嚴(yán)重影響愈傷組織的生長(zhǎng)與代謝，也是一些植物組織培養(yǎng)能否取得成功的決定性因素。褐化發(fā)生與外植體體內(nèi)酚類物質(zhì)的含量呈正相關(guān)，而酚類化合物種類較多，不同植物類型所含的酚類物質(zhì)種類各不相同，尋找酶促褐變的主要底物能為控制組培褐化提供重要的理論依據(jù)[7]。

本試驗(yàn)擬通過(guò)向培養(yǎng)基添加不同類型的防褐化劑，探究其對(duì)已褐化的南方紅豆杉愈傷組織的生長(zhǎng)及褐化情況的影響，測(cè)定愈傷組織中PPO和POD活性及酚類物質(zhì)含量的變化。旨在為抑制紅豆杉愈傷組織褐化提供一定的科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步揭示與褐化相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南方紅豆杉愈傷組織：以南方紅豆杉一年生枝條為外植體經(jīng)誘導(dǎo)后獲得，繼代培養(yǎng)至5代以上[8]； B5培養(yǎng)基：青島海博生物。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 抗氧化劑處理 用不同抗氧化劑處理繼代后的褐化愈傷組織，抗氧化劑為過(guò)濾滅菌后的硫代硫酸鈉(hypo)、檸檬酸(CA)、抗壞血酸（VC），濃度分別為100 mg/L，以不添加抗氧化劑為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每隔5 d觀察愈傷組織生長(zhǎng)及褐化程度并檢測(cè)細(xì)胞中PPO和POD活性及酚類物質(zhì)的含量。

1.2.2 吸附劑處理 分別向固體培養(yǎng)基中加入活性炭(AC)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，濃度分別為0.5 g/L，以不添加吸附劑為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每隔5d觀察愈傷組織生長(zhǎng)及褐化程度并檢測(cè)細(xì)胞中PPO和POD活性及酚類物質(zhì)的含量。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)的測(cè)定 生長(zhǎng)指數(shù)=（收獲量–接種量）/接種量×100%

1.3.2 愈傷組織褐變強(qiáng)度測(cè)定 觀察愈傷組織的顏色，并按其褐化程度可以將其分為4個(gè)等級(jí)：1 級(jí)：表示沒(méi)有褐化，表示符號(hào)（–）；2 級(jí)：表示輕微褐化，表示符號(hào)（+）；3 級(jí)：表示褐化嚴(yán)重，表示符號(hào)（++）；4 級(jí)：表示褐化非常嚴(yán)重，表示符號(hào)（+++）。

1.3.3 PPO和POD活性測(cè)定 PPO提取與活性測(cè)定參照張?jiān)铝岬萚9]方法；POD提取與活性測(cè)定參照隋麗等[10]方法。

1.3.4 總酚含量的測(cè)定 總酚提?。喝∮鷤M織1 g，加甲醇研磨成勻漿，用甲醇定容10 mL，55 ℃超聲提取30 min，4 000 r/min離心10 min，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后的濾液為待測(cè)提取液?？偡雍繙y(cè)定方法采用福林酚法[11-12]測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，誤差分析采用Duncan新復(fù)極差法；作圖采用Origin 8.5.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同防褐化劑處理對(duì)外植體褐化的影響

褐化的愈傷組織(圖1A)經(jīng)防褐化劑處理后，重新長(zhǎng)出狀態(tài)較好的愈傷組織(圖1B)。每個(gè)處理下的個(gè)體差異較大，整體的褐化狀況如表1所示。

表1 第20天愈傷組織褐化程度

圖1 對(duì)照與防褐化劑處理愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)

2.2 不同防褐化劑處理對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)的影響

由圖2A可知與對(duì)照相比，5種防褐化劑在不同時(shí)期均對(duì)褐化細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其中以PVP效果最好，在第20天時(shí)，PVP的細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)為112.18%，CA為44.20%，VC為40.32%，hypo為39.31%，AC為27.72%，CK為17.83%。

2.3 不同防褐化劑處理對(duì)總酚含量的影響

第5天時(shí)，PVP和AC處理的總酚含量均高于對(duì)照，而hypo、VC、CA處理的胞內(nèi)總酚含量低于對(duì)照，隨著時(shí)間的增加，PVP處理的總酚含量逐漸低于對(duì)照，而AC處理的胞內(nèi)總酚含量仍高于對(duì)照。第20天時(shí)，CA處理的總酚含量最低，低于對(duì)照108.82%，其次為hypo處理，總酚含量低于對(duì)照77.50%（圖2B）。

圖2 不同防褐化劑處理對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)和總酚含量的影響

2.4 不同防褐化劑處理對(duì)PPO活性的影響

由圖3A可知，在培養(yǎng)的第5天，PVP和AC處理的PPO活性高于對(duì)照，而hypo、VC、CA處理的PPO活性低于對(duì)照，hypo處理的PPO活性最低，低于對(duì)照166.18%；隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，PVP和AC處理的PPO酶活性逐漸低于對(duì)照酶活性，hypo、VC、CA處理的PPO酶活性呈先增后減的趨勢(shì)；15 d以后，所有處理的PPO活性均低于對(duì)照，第20天時(shí)，hypo處理的PPO活性最低，低于對(duì)照78.77%。

2.5 不同防褐化劑處理對(duì)POD活性的影響

在培養(yǎng)的第5天，對(duì)照POD活性均高于防褐化劑處理，PVP、AC處理的POD活性高于hypo、VC、CA處理的POD活性；隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，PVP和AC處理的POD酶活性逐漸低于對(duì)照酶活性，hypo、VC、CA處理的POD酶活性呈先減后增的趨勢(shì)；第15天時(shí)，所有處理的POD活性均低于對(duì)照，VC處理的POD活性最低，低于對(duì)照604.92%（圖3B）。

圖3 不同防褐化劑處理對(duì)PPO和POD活性的影響

3 討 論

褐化是復(fù)雜的生化過(guò)程，就是組織內(nèi)或傷口處分泌的酚類化合物在多酚氧化酶等作用下發(fā)生的氧化反應(yīng)從而形成了褐色的醌類物質(zhì)，酶促褐化必須具備酶、底物和氧3個(gè)條件[13-14]。醌類化合物在酪氨酸酶的作用下，與培養(yǎng)材料中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，引起酶系統(tǒng)失活，從而導(dǎo)致植物細(xì)胞代謝紊亂生長(zhǎng)受阻[15]。

葉梅、羅曉芳等[16-17]的研究表明，多酚氧化酶的活性與組織培養(yǎng)材料的褐變不呈正相關(guān)，但酚類物質(zhì)的總含量與褐變有一定的關(guān)系。與PPO相比，POD參與酶促褐化反應(yīng)的作用非常有限[18]。印芳等[19]在蝴蝶蘭的研究中發(fā)現(xiàn)，褐化程度高的品種，總酚含量也較高。

防褐劑一般可分為抗氧化劑和吸收劑兩大類，PVP和AC作為吸附防褐化劑，對(duì)褐化細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其對(duì)PPO和POD酶活抑制效果一般，能降低的細(xì)胞中總酚含量，其可能的作用機(jī)制是防褐化吸附劑通過(guò)降低培養(yǎng)基中總酚含量來(lái)達(dá)到防褐化效果。hypo、VC、CA作為抗氧化防褐化劑，能明顯抑制PPO和POD酶活，這是因?yàn)榭寡趸瘎┓篮只瘎┠芘c酶發(fā)生竟?fàn)幮越Y(jié)合的，從而降低酶活，降低酶促褐化，減少有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒害。

本試驗(yàn)所選的5種防褐化劑在降低紅豆杉細(xì)胞褐化均具有一定效果。從抑制PPO和POD酶活性效果來(lái)看，抗氧化防褐化劑效果好于吸附防褐化劑；添加抗氧化防褐化劑的紅豆杉細(xì)胞中總酚含量低于吸附防褐化劑?？寡趸篮只瘎┲?，綜合比較，hypo抗褐化效果最好，其原因有可能是加入VC和CA會(huì)使培養(yǎng)基pH值下降，影響細(xì)胞生長(zhǎng)代謝。所以培養(yǎng)基中添加防褐化劑濃度應(yīng)該控制在即具有顯著防褐化效果，又不影響外植體的生長(zhǎng)分裂和分化。

綜上所述，向培養(yǎng)基中加入防褐化劑，可減輕愈傷組織褐化，細(xì)胞酚類物質(zhì)含量減少，PPO和POD活性下降。因此，通過(guò)降低愈傷組織中總酚含量和PPO、POD活性來(lái)抑制褐化在理論上是可行的。在后續(xù)的研究中，需要尋找并調(diào)節(jié)與總酚含量直接相關(guān)的酶、PPO、POD及其基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑制紅豆杉愈傷組織褐化的目的。

[1]肖遙, 楚秀麗, 徐肇友, 等. 南方紅豆杉2年生容器苗多點(diǎn)試驗(yàn)的生長(zhǎng)節(jié)律家系變異[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2016, 29(2): 238-244.

[2]姚曉, 步達(dá), 陳建偉, 等. 南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)及其紫杉烷二萜類成分的分析[J]. 中草藥, 2014, 45(18): 2696-2702.

[3] Zhang F, Wang P, Ji D, et al. Asymmetric somatic hybridization betweenWilld. andvar. mairei[J]. Plant Cell Reports, 2011, 30(10): 1857-1864.

[4] Jennewein S, Croteau R. Taxol: biosynthesis, molecular genetics, and biotechnological applications[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 57(1/2): 13-19.

[5]黃洲, 陳思, 龐基良. 辣木組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 37(4): 44-47.

[6]符真珠, 杜君, 何松林, 等. 酚類物質(zhì)與牡丹試管苗褐變關(guān)系的初步分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2016, 30(1): 201-207.

[7] Dalal M, Sharma B, Rao M. Studies on stock plant treatment and initiation culture mode in control of oxidative browning in in vitro cultures of grapevine[J]. Scientia Horticulturae, 1992, 51(1/2): 35-41.

[8]徐志榮, 簡(jiǎn)方敏, 劉伯卿, 等. 南方紅豆杉外植體的消毒和愈傷組織的培養(yǎng)[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2016, 39(3): 215-219.

[9]張?jiān)铝? 肖尊安, 熊紅. 紅豆杉愈傷組織生長(zhǎng)與PPO,POD比活性和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的研究[J]. 北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2002, 38(6): 800-801.

[10]隋麗, 徐文靜, 杜茜, 等. 放線菌769發(fā)酵液對(duì)水稻體內(nèi)主要防御酶活性的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 31(4): 382-384.

[11]顏小捷, 谷陟欣, 盧鳳來(lái), 等. FOLIN-酚比色法測(cè)定裸花紫珠中總酚含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2013, 19(18): 74-78.

[12]鄭超, 徐晟, 夏冰, 等. 三種抗氧化劑對(duì)曼地亞紅豆杉愈傷組織褐化及相關(guān)物質(zhì)含量的影響[J]. 植物生理學(xué)報(bào), 2013, 49(3):259-263.

[13]李萍, 成仿云, 張穎星. 防褐劑對(duì)牡丹組培褐化發(fā)生、組培苗生長(zhǎng)和增殖的作用[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008,30(2): 71-76.

[14]馮代弟, 王燕, 陳劍平. 植物組培褐化發(fā)生機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 27(6): 1108-1116.

[15] Vaughn K C, Lax A R, Duke S O. Polyphenol oxidase: The chloroplast oxidase with no established function[J]. Physiologia Plantarum, 1988(72): 659-665.

[16]葉梅. 植物組織褐變的研究進(jìn)展[J]. 重慶工商大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2005, 22(4): 326-329.

[17]羅曉芳, 田硯亭, 姚洪軍. 組織培養(yǎng)過(guò)程中PPO活性和總酚含量的研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1999(1): 92-95.

[18] Zhang Y P, Li Q M, Zhao X H, et al. The study of indirect determination of tiopronin by extraction flotation copper(II) with an ammonium sulfate-water-n-propyl alcohol system[J]. Journal of the Chinese Chemical Society, 2007, 54(3): 743-748.

[19]印芳, 葛紅, 彭克勤, 等. 蝴蝶蘭組培褐變與酚酸類物質(zhì)及相關(guān)酶活性的關(guān)系[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41(7): 2197-2203.

Effects of Browning Antagonists on Callus Browning and Its Related Substance Contents in

LI Zhang, XU Zhi-rong, LOU Jia-lan, TAN Xiao-lin, LIU Yi-ting, SHANGGUAN Tao-feng, WEI Sai-jin*

(College of Biological Science and Engineering/Jiangxi Agricultural Microbial Resource Development and Utilization Engineering Lab, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

var.callus were selected as suitable materials and treated with a variety of different browning antagonists, including polyvinyl pyrrolidone (PVP), activated carbon (AC) , vitamin C (VC), citric acid (CA) and sodium thiosulfate (hypo), and the effects of them on the growth and browning ofvar.callus were assessed. The changes in the activity of polyphenol oxidase (PPO) and peroxidase (POD) and the content of phenolic acids in the callus in different time were measured. The results showed that PVP had the best effect on cell growth; Activities of PPO were reduced by 78.77% at their lowest levels under treatments with hypo in the 20th day, and activities of POD were reduced by 604.92% at their lowest levels under treatments with VC in the 15th day; Total phenolic content was decreased by 108.82% at their lowest levels under treatments with CA in the 20th day. SO, 5 browning antagonists were effective to reduce callus browning invar.callus.

var.; callus; browning antagonists; phenolic compounds;enzyme activity

Q942.5

A

2095-3704（2018）01-0069-05

2018-01-26

江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（20133BBG70090）和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201710410067）

李張（1993—），男，碩士生，主要從事植物生理學(xué)研究，905092083@qq.com；

通信作者：魏賽金，教授，博士，weisaijin@126.com。

李張, 徐志榮, 婁佳蘭, 等. 防褐化劑對(duì)南方紅豆杉愈傷組織褐化及相關(guān)物質(zhì)含量的影響[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2018, 41(1): 69-73.